羅孝全 唐 輝 馮 浩 陳 兵 孫 謀

腦膠質(zhì)瘤在臨床組織學(xué)和遺傳學(xué)上都具有較高的異質(zhì)性，例如低級別膠質(zhì)瘤普遍存在異檸檬酸脫氫 酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）突 變[1]。lncRNA MIR4435-2H 是一種新的致癌基因[2]。本文探討lncRNA MIR4435-2HG的表達(dá)水平及甲基化狀態(tài)與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2019年1～12月手術(shù)切除的腦膠質(zhì)瘤組織110例，其中男51例，女59例；中位年齡52歲；低級別膠質(zhì)瘤（WHO分級Ⅰ～Ⅱ級）65例，高級別膠質(zhì)瘤（WHO 分級Ⅲ～Ⅳ級）55 例；IDH1 突變46例。另外選取顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)中切除正常腦組織20 例為對照，其中男13 例，女7 例；中位年齡50 歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測MIR4435-2HG 表達(dá)術(shù)中獲取組織標(biāo)本迅速置于液氮中，24 h 后放到-80 ℃長期保存。另外，所有病人初診時(shí)采集血液樣本，留取血清，置于-80 ℃保存。使用QIAamp Min?Elute Virus Spin 試劑盒 和Qiamp DNA/RNA FFPE 組織試劑盒（德國Qiagen公司）分別提取血清和石蠟包埋組織快中RNA。使用SensiFASTTM cDNA 合成試劑盒（美國Bioline 公司）對2μg RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。以1μg 稀釋后cDNA 為模板，用SYBR Green Master Mix 試劑盒（美國Bio-Rad 公司）制備qPCR 反應(yīng)混合物。以GAPDH 作為內(nèi)源性對照?；?-ΔΔCT方法，MIR4435-2HG表達(dá)被標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)源性控制GAPDH。

1.3 MIR4435-2HG 基因啟動子甲基化檢測 使用EpiTect bisulfite 試劑盒（德國Qiagen 公司）進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理，并用Wizard DNA 純化樹脂（美國Pro?mega 公司）對修飾后的DNA 樣品進(jìn)行純化。使用200 ng DNA 進(jìn)行甲基化特異性PCR（methylationspecific PCR，MSP）擴(kuò)增。分別用甲基化或非甲基化DNA 序列的特異性引物來區(qū)分MIR4435-2HG 甲基化。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。僅出現(xiàn)甲基化引物的陽性擴(kuò)增被解釋為完全甲基化，同時(shí)出現(xiàn)甲基化和非甲基化引物的陽性擴(kuò)增被視為部分甲基化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 利用SPSS 19.0軟件分析；計(jì)量資料以x±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析鑒別效能；采用Kappa 值判斷一致性，≥0.75為一致性好，0.40～0.75為一致性一般，＜0.4為一致性較差；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤MIR4435-2HG 表達(dá)水平和甲基化狀態(tài) 與對照組相比，腦膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG 水平均明顯增高（P＜0.05），而甲基化率明顯降低（P＜0.05）。與低級別膠質(zhì)瘤相比，高級別膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG 水平明顯增高（P＜0.05），而甲基化率明顯降低（P＜0.05）。與IDH1 野生型膠質(zhì)瘤相比，IDH1 突變型膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG水平明顯降低（P＜0.05），而甲基化率明顯增高（P＜0.05）。見表1。

2.2 腦膠質(zhì)瘤MIR4435-2HG 甲基化狀態(tài)和表達(dá)量的關(guān)系MIR4435-2HG 甲基化組膠質(zhì)瘤組織（1.83±0.64）和血清（1.51±0.38）MIR4435-2HG 水平明顯低于非甲基化組（分別為2.95±0.87、2.12±0.51；P＜0.05）。Kappa 分析顯示，腦膠質(zhì)瘤組織MIR4435-2HG 甲基化率與其表達(dá)水平一致性良好（Kappa=0.782，P＜0.05），與血清MIR4435-2HG水平一致性一般（Kappa=0.636，P＜0.05）。

2.3 ROC 曲線分析結(jié)果 血清MIR4435-2HG 水平鑒別腦膠質(zhì)瘤級別的曲線下面積為0.752（95%置信區(qū)間0.701～0.804），最佳截?cái)嘀禐?.98，靈敏度和特異度分別為65.0%和91.5%。見圖1。

表1 腦膠質(zhì)瘤lncRNA MIR4435-2HG表達(dá)水平及其基因啟動子甲基化狀態(tài)

圖1 ROC曲線分析血清MIR4435-2HG水平鑒別診斷腦膠質(zhì)瘤級別的效果

3 討論

2016年，WHO首次將分子生物標(biāo)志物與典型的組織學(xué)特征結(jié)合起來，以確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞型以及惡性化程度[3]。MIR4435-2HG 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。本研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG 水平均明顯高于對照組（P＜0.05）；并且，高級別膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG水平升高更明顯。這說明MIR4435-2HG 可能參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生，可能與膠質(zhì)瘤病理分級有觀。

2013 年，Cao 等[4]首次在肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG 呈低甲基化狀態(tài)。Xu 等[5]證實(shí)MIR4435-2HG 可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲活性，其作用機(jī)制可能是靶向miR-1224-5p/TGFBR2軸，進(jìn)而驅(qū)動腦膠質(zhì)瘤惡性化進(jìn)程。Reon 等[6]通過Paris 和ribo-seq 數(shù)據(jù)，結(jié)合二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，在MIR4435-2HG 基因的3'端發(fā)現(xiàn)一個與蛋白結(jié)合的121 bp 的干環(huán)結(jié)構(gòu)，通過一種需要發(fā)夾結(jié)構(gòu)完整性的機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)MIR4435-2HG 啟動子兩個不同的區(qū)域檢測到CpG位點(diǎn)，利用平行RNA 表達(dá)和DNA 甲基化數(shù)據(jù)以及Kappa 一致性分析，證實(shí)DNA 甲基化與MIR4435-2HG表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示MIR4435-2HG的轉(zhuǎn)錄可能受到DNA甲基化的調(diào)控。

IDH 突變是膠質(zhì)瘤發(fā)生的早期事件，與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移減弱、增殖減少等途徑有關(guān)。IDH1R132H和IDH2R172K替換是最常見的情況，使IDH產(chǎn)生一種新的酶活性，催化α-KG生成一種抑制α-KG 依賴性酶的腫瘤代謝物，導(dǎo)致廣泛的基因組DNA 甲基化[7]。本研究發(fā)現(xiàn)IDH1 突變型膠質(zhì)瘤組織和病人血清MIR4435-2HG 表達(dá)水平明顯低于IDH1 野生型膠質(zhì)瘤，同時(shí)MIR4435-2HG 甲基化率明顯增高。這說明MIR4435-2HG 甲基化上調(diào)可能與IDH1突變有關(guān)。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤，尤其是高級別膠質(zhì)瘤，血清MIR4435- 2HG 水平普遍升高，檢測血清MIR4435-2HG 水平有助于鑒別診斷腦膠質(zhì)瘤級別。MIR4435-2HG轉(zhuǎn)錄受到DNA甲基化調(diào)控，并且與IDH1突變有關(guān)，但是具體的調(diào)控機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。