程秋華 周帥 向楊 楊樹(shù)龍 符國(guó)珍

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院肝膽外科（海口570208）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，在肝硬化患者中多見(jiàn)［1］。在過(guò)去的二十年中，HCC 的發(fā)病率和死亡率居高不下，大多數(shù)HCC 患者發(fā)生在東亞、東南亞和非洲等地區(qū)［2］。HCC 患者5 年生存率僅在5%左右，臨床預(yù)后不佳［3］。目前，HCC 的具體發(fā)病機(jī)制仍不明確。因此，更好地了解病因和進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵因素和調(diào)控途徑，對(duì)新的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)以及HCC 患者臨床治療的改善具有重要意義。

脯氨酸在細(xì)胞增殖、凋亡及自噬中扮演重要角色［4］。PYCR1 能夠催化NADP 依賴的吡咯啉-5-羧酸轉(zhuǎn)化成脯氨酸，在脯氨酸的生物合成中發(fā)揮重要作用［5］。有研究［6］指出，人類PYCR1 基因突變可引起皮膚松弛癥。此外，PYCR1 基因在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及化療敏感性相關(guān)［7-10］。最近一項(xiàng)研究［11］報(bào)道指出，HCC 組織中PYCR1 mRNA 和蛋白水平均顯著高于癌旁組織。然而，HCC 患者中PYCR1 表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。本研究通過(guò)探討PYCR1 表達(dá)水平與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為HCC 患者臨床治療靶點(diǎn)選擇提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象80例HCC患者病理標(biāo)本均為中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院肝膽外科2015 年1 月至2018 年12 月收集，隨訪資料完整。本研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器總RNA提取試劑盒（DP419，TIANGEN，北京）；qRT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FP314，TIANGEN，北京）；SYBR@Premix Ex TaqTMII 試劑盒（RR820A，TaKaRa，大連）；PYCR1 抗體和GAPDH抗體（ab102601/ab8245，Abcam，美國(guó)）；甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein，AFP）檢測(cè)試劑盒（LT5020401，藍(lán)圖生物，黃石）；癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）檢測(cè)試劑盒（YKE-C14，研科生物，廣州）。

1.3 PYCR1 mRNA 表達(dá)水平測(cè)定利用總RNA提取試劑盒采用離心柱法提取HCC 及癌旁組織總RNA；A260/A280范圍為1.8 ～2.0，計(jì)算mRNA 濃度；將瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)完整性良好的RNA按照qRT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃冰箱保存待用；以β-actin 為內(nèi)參基因，PYCR1 引物序列為：上游5′-CGCCGACATTGAGGACAGAC-3′，下游5′-CGACTGGAGTGTTGGTCATGC-3′，根據(jù)SYBR@Premix Ex TaqTMII 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果以2-△△Ct方法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.4 PYCR1 蛋白表達(dá)水平測(cè)定HCC 及癌旁組織蛋白采用蛋白裂解法收集；BCA 法檢測(cè)蛋白含量，確保各孔上樣量相等，進(jìn)行垂直電泳，轉(zhuǎn)膜，TBS 漂洗，封閉液封閉2 h；加入兔抗人PYCR1 和GAPDH 單克隆抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗滌后加人二抗，在室溫下30 min 后，再TBST 洗滌，暗室內(nèi)發(fā)光顯影。

1.5 PYCR1免疫組織化學(xué)染色方法及分組HCC組織標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片；60 ℃烘片，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇復(fù)水，檸檬酸緩沖液高壓修復(fù)抗原，3%雙氧水封閉后滴加一抗與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗，染色并封片，其他按照試劑盒說(shuō)明書操作。PYCR1表達(dá)量判定方法：由3 位病理學(xué)醫(yī)師采用雙盲法在顯微鏡下觀察組織切片上每個(gè)小塊的所有區(qū)域，判定染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率。染色強(qiáng)度評(píng)分：0 分（陰性）、1 分（陽(yáng)性）、2 分（強(qiáng)陽(yáng)性）。染色陽(yáng)性率評(píng)分：0 分，1 分（1% ～25%），2 分（26% ～50%），3分（51%～75%），4分（76%～100%）。以染色強(qiáng)度評(píng)分和染色陽(yáng)性率評(píng)分的乘積為總評(píng)分，＜4 分為PYCR1 低表達(dá)，≥4 分為PYCR1 高表達(dá)［12］。本研究中，PYCR1 低表達(dá)22 例，PYCR1 高表達(dá)58 例，見(jiàn)圖1。

圖1 PYCR1 在HCC 組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of PYCR1 in HCC tissues

1.6 隨訪采用電話或患者來(lái)院就診的方式對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪至患者死亡或2020 年9 月1 日。記錄兩組患者5 年無(wú)瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間。隨訪時(shí)間13 ～63 個(gè)月，平均（48.02 ±12.35）個(gè)月。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)影響HCC 患者預(yù)后的因素進(jìn)行單因素、多因素分析。采用Kaplan-Meier 法繪制HCC 患者生存曲線，并應(yīng)用Log-rank法進(jìn)行差異性檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)采用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PYCR1在HCC和癌旁組織中表達(dá)水平比較HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于癌旁對(duì)照組（均P＜0.05）。見(jiàn)表1，圖2。

表1 PYCR1 在HCC 和癌旁組織中表達(dá)水平比較Tab.1 Expression of PYCR1 in HCC and adjacent tissues±s

表1 PYCR1 在HCC 和癌旁組織中表達(dá)水平比較Tab.1 Expression of PYCR1 in HCC and adjacent tissues±s

組別HCC 組癌旁對(duì)照組t 值P 值例數(shù)80 80 PYCR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量2.26±0.48 0.84±0.22 24.054＜0.001 PYCR1 蛋白相對(duì)表達(dá)量1.45±0.31 0.59±0.17 21.756＜0.001

圖2 PYCR1 在HCC 和癌旁組織蛋白表達(dá)水平Fig.2 Protein expression levels of PYCR1 in HCC and paracancerous tissues

2.2 HCC組織中PYCR1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系HCC組織中PYCR1表達(dá)水平與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、血管侵犯、TNM 分期有關(guān)（均P＜0.05），其余指標(biāo)無(wú)相關(guān)性（均P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 HCC 組織中PYCR1 表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between expression level of PYCR1 and clinicopathological characteristics in HCC例（%）

2.3 影響HCC 患者預(yù)后的單因素、多因素Cox 回歸分析Cox 回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤大小、衛(wèi)星灶、血管侵犯、TNM 分期、PYCR1 表達(dá)水平是影響HCC患者5年總體生存率的獨(dú)立因素（均P＜0.05）；血管侵犯、TNM 分期、PYCR1 表達(dá)水平是影響HCC患者5 年無(wú)瘤生存率的獨(dú)立因素（均P＜0.05）。見(jiàn)表3、4。

表3 影響HCC 患者預(yù)后的單因素Cox 回歸分析Tab.3 Univariate Cox regression analysis of prognosis in patients with HCC

表4 影響HCC 患者預(yù)后的多因素Cox 回歸分析Tab.4 Multivariate Cox regression analysis of prognosis in patients with HCC

2.4 HCC組織中PYCR1表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果顯示，HCC 組織中PYCR1 低表達(dá)組患者5 年總體生存率、無(wú)瘤生存率明顯高于PYCR1 高表達(dá)組（均P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

3 討論

圖3 HCC 組織中PYCR1 表達(dá)水平與5 年總體生存率和無(wú)瘤生存率的關(guān)系Fig.3 Relationship between PYCR1 expression and 5 years overall survival rate and disease-free survival rate in HCC

據(jù)報(bào)道，50% ～90%接受HCC 根治切除術(shù)的患者最終都死于腫瘤復(fù)發(fā)［13］。因此，早期發(fā)現(xiàn)是提高HCC 患者生存率的有效策略之一。迄今為止，許多臨床病理特征和生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)與HCC 患者預(yù)后顯著相關(guān)［14-15］。然而，對(duì)影響HCC預(yù)后因素的識(shí)別遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以使既往研究結(jié)果普遍應(yīng)用于臨床。本研究選擇與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及化療敏感性相關(guān)的PYCR1 基因，從mRNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量方面入手，比較HCC 組織與癌旁組織中PYCR1 表達(dá)差異。通過(guò)免疫組織化學(xué)法，確定PYCR1 高表達(dá)和低表達(dá)組，分析PYCR1 表達(dá)水平與HCC 患者臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于癌旁對(duì)照組，組織中PYCR1 表達(dá)水平是影響HCC 患者5 年無(wú)瘤生存率和總體生存率的獨(dú)立因素，HCC 組織中PYCR1 低表達(dá)組患者5 年總體生存率、無(wú)瘤生存率高于PYCR1 高表達(dá)組。

有報(bào)道［16］指出，脯氨酸代謝過(guò)程中的兩個(gè)關(guān)鍵酶脯氨酸脫氫酶/脯氨酸氧化酶和PYCR1 與惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。PYCR1是廣泛存在于人體各種組織細(xì)胞中的一種線粒體酶，可將NAD（P）H+的氧化還原產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，在細(xì)胞中促進(jìn)脯氨酸合成。有研究證實(shí)，PYCR1 是原癌基因c-myc 的靶點(diǎn)，發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞凋亡和抗氧化的作用［17］。DING 等［18］的研究指出，乳腺癌的形成與谷氨酸-脯氨酸代謝密切相關(guān)，PYCR1 在乳腺癌組織中高表達(dá)，其mRNA 水平與乳腺癌患者生存率呈負(fù)相關(guān)；此外，體外研究［18］證實(shí)，siRNA 干擾PYCR1 基因后，乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力受到抑制。FU 等［19］的研究指出，PYCR1 mRNA 和蛋白水平在腎癌組織中高表達(dá)，與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致；PYCR1 蛋白水平檢測(cè)對(duì)腎癌的診斷具有一定的準(zhǔn)確性；PYCR1 是腎癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。謝智彬等［20］通過(guò)探討PYCR1 在膀胱癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，發(fā)現(xiàn)PYCR1 在膀胱癌中高表達(dá)，并與年齡、病理分級(jí)、N 分期、T 分期、M 分期和臨床分期密切相關(guān)，提示PYCR1 參與了膀胱癌的發(fā)生及進(jìn)展。上述研究表明，PYCR1 或許可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的一種新型標(biāo)志物，并有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。PYCR1 與HCC 關(guān)系的研究報(bào)道不多，最近一項(xiàng)研究報(bào)道［11］，HCC 組織中PYCR1 mRNA 和蛋白水平均顯著高于癌旁組織，通過(guò)抑制HCC 細(xì)胞株BEL-7404 細(xì)胞和SMMC-7721 細(xì)胞中PYCR1 的表達(dá)之后，肝癌細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，細(xì)胞凋亡率顯著升高，這一過(guò)程受到c-Jun 氨基末端激酶/胰島素受體底物1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)；裸鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了干擾PYCR1 表達(dá)可顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，瘤體的體積和重量顯著縮小。本研究與上述研究結(jié)果一致，結(jié)果顯示HCC 組中PYCR1 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于癌旁對(duì)照組。本研究還發(fā)現(xiàn)，組織中PYCR1 表達(dá)水平與腫瘤大小、衛(wèi)星灶、血管侵犯、TNM 分期有關(guān)，提示PYCR1 發(fā)揮的潛在機(jī)制可能與大腫瘤（＞5 cm）患者的比例增加、形成腫瘤衛(wèi)星灶、促進(jìn)血管侵犯和TNM 分期進(jìn)展有關(guān)。

本研究為單中心研究，樣本量較少，影響統(tǒng)計(jì)效能，還需大樣本、多中心研究加以驗(yàn)證?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)PYCR1 基因在HCC 組織中高表達(dá)，并與HCC 患者臨床病理特征存在相關(guān)性，提示PYCR1 可能參與了HCC 的發(fā)生、發(fā)展。PYCR1 表達(dá)水平與HCC 患者預(yù)后關(guān)系密切，提示PYCR1 或許可作為一種新的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。然而，PYCR1 與HCC 之間關(guān)系的確切機(jī)制目前尚未明確，后續(xù)研究還應(yīng)建立過(guò)表達(dá)及沉默PYCR1 的HCC 細(xì)胞株模型，探討其參與HCC 發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制。