葉美鳳 蘇珊 岑文昌 張言斌

1廣州醫(yī)科大學(xué)（廣州511436）；2廣州市胸科醫(yī)院（廣州501595）

粟粒型肺癌是一種特殊類型的肺癌，主要表現(xiàn)為影像學(xué)上大量彌漫的、微小的（≤3 mm）的肺小結(jié)節(jié)，多為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）血行轉(zhuǎn)移形成［1］。文獻(xiàn)報(bào)道，絕大多數(shù)粟粒型肺癌為肺腺癌，且表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變率高達(dá)70% ～86%［2-3］。近年來，EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-tyrosine kinase inhibitor，EGFRTKI）在指南中被推薦為EGFR 突變的晚期NSCLC患者的首選一線治療。既往臨床研究顯示，接受EGFR-TKIs 治療的EGFR 敏感突變NSCLC 患者，中位無疾病進(jìn)展時(shí)間（progression-free survival time，PFS）達(dá)到8 ～13個(gè)月，與傳統(tǒng)的一線化療4 ～6個(gè)月的中位PFS 相比，TKIs 展現(xiàn)出了極大的優(yōu)勢［4-5］。有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，粟粒型肺腺癌患者一線接受EGFR-TKI 治療的PFS 大約在4 ～8 個(gè)月［3，6］，預(yù)后明顯比非粟粒型肺癌差。但是，粟粒型肺癌患者接受靶向治療效果不佳的內(nèi)在原因仍需進(jìn)一步的研究。

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境，不僅包括腫瘤細(xì)胞本身，還有其周圍的成纖維細(xì)胞、免疫和炎性細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等各種細(xì)胞，以及細(xì)胞間質(zhì)、微血管等［7］。程序性死亡分子配體1（programmed death ligand 1，PD-L1），在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，與其受體程序性死亡分子PD-1（programmed death 1）結(jié)合可抑制腫瘤免疫效應(yīng)［8］。TENG 等［9］根據(jù)PD-L1 的表達(dá)和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TIL）的狀態(tài)，將腫瘤微環(huán)境分成四種免疫表型，其中I 型腫瘤微環(huán)境中PD-L1高表達(dá)且存在大量CD8+TILs，因此被認(rèn)為是免疫炎癥型的腫瘤微環(huán)境，對以PD1/PD-L1 通路為靶點(diǎn)的免疫治療響應(yīng)。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境可能還參與了靶向治療的耐藥。MASSI 等［10］發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤微環(huán)境中的免疫抑制成分在BRAF 抑制劑反應(yīng)改善中發(fā)揮重要作用。在肺癌中，MATSUMOTO 等［11］發(fā)現(xiàn)，微環(huán)境的免疫表型與EGFRTKI 療效密切相關(guān)。前期研究也證實(shí)，PD-L1 的表達(dá)陽性與EGFR-TKI 耐藥有關(guān)［12］。而既往研究發(fā)現(xiàn)，粟粒型肺癌患者，EGFR 突變幾率較高，且接受靶向治療效果不佳，這其中是否也有免疫因素的參與，目前尚不清楚。

因此，本回顧性研究通過免疫組化方法檢測粟粒型肺癌患者PD-L1 和CD8 的表達(dá)，擬明確粟粒型肺癌患者腫瘤微環(huán)境免疫表型的特點(diǎn)，并進(jìn)一步探索其是否影響EGFR-TKI 的療效，為免疫因素參與靶向治療的耐藥提供新的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象回顧性收集2017 年3 月至2019 年3 月廣州市胸科醫(yī)院收治的147 例EGFR 突變并接受EGFR-TKI 治療的IV 期NSCLC 患者。根據(jù)影像學(xué)是否表現(xiàn)為大量彌漫性的、微小的（≤3 mm）的肺小結(jié)節(jié)，將患者分為粟粒型肺癌組（A 組，49 例）和非粟粒型肺癌組（B 組，98 例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)確診為NSCLC；（2）病理學(xué)分期為Ⅳ期；（3）具有EGFR 基因突變；（4）組織標(biāo)本足夠行免疫組織化學(xué)檢測；（5）病理確診后曾接受采用EGFR-TKI 治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）取得組織標(biāo)本前曾接受過抗腫瘤治療；（2）合并其他腫瘤或嚴(yán)重疾病者。從醫(yī)院電子數(shù)據(jù)中收集患者性別、年齡、吸煙史、臨床分期、EGFR 突變類型等臨床基線特征。該研究已得到廣州市胸科醫(yī)院評審和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者在參加本研究前均已獲得知情同意。

1.2 結(jié)果評估所有患者在接受EGFR-TKI 治療期間每3 個(gè)月進(jìn)行一次胸部CT 檢查隨訪。根據(jù)實(shí)體腫瘤反應(yīng)評估標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）1.1 版確定治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展的定義。無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）被定義為從接受EGFR-TKI治療開始到疾病進(jìn)展或死亡的時(shí)間。在最后一次隨訪中，如果沒有疾病進(jìn)展（PFS），則對患者進(jìn)行審查。

1.3 免疫組化染色所有腫瘤標(biāo)本均為患者首診時(shí)通過活檢獲得。采用免疫組化法檢測腫瘤組織中PD-L1（22C3，Dako，Carpinteria，CA）及淋巴細(xì)胞CD8（C8/144B，上海基因科技有限公司，中國）的表達(dá)。所有的IHC 分析都由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富且不知患者臨床信息的病理學(xué)家進(jìn)行評估。PD-L1 表達(dá)采用3 級(jí)分級(jí)系統(tǒng)定義：≥50%為強(qiáng)陽性，1% ～49%為弱陽性，＜1%為陰性表達(dá)。CD8 陽性的標(biāo)準(zhǔn)為表達(dá)CD8 的淋巴細(xì)胞在腫瘤間質(zhì)中所占的比例，＜10%為陰性，≥10%為陽性。

1.4 治療方法粟粒型肺癌組患者均接受過EGFR-TKI治療，其中一線治療40例（81.63%），二線治療9 例（18.37%）。接受EGFR-TKI 一線治療的藥物包括吉非替尼（13 例，32.5%）、埃克替尼（15 例，37.5%）、厄洛替尼（7 例，17.5%）和阿法替尼（5 例12.5%），二線治療包括吉非替尼（6 例，66.67%）、厄洛替尼（2例，22.22%）和阿法替尼（1例11.11%）。非粟粒型肺癌組患者均接受一線EGFR-TKI 治療，包括吉非替尼（41 例，41.84%）、?？颂婺幔?5 例，35.71%）、厄洛替尼（13 例，13.27%）和阿法替尼（9 例9.18%）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及GraphPad Prism 8.0 繪圖。采用χ2檢驗(yàn)評估粟粒型肺癌和非粟粒型肺癌患者間PD-L1 和CD8 表達(dá)以及治療反應(yīng)的差異。采用χ2檢驗(yàn)比較不同PD-L1表達(dá)患者的治療反應(yīng)。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，并進(jìn)行Log-rank 檢驗(yàn)。采用Cox 回歸方法分析PFS 的預(yù)后因素。采用Logistic 回歸分析方法分析粟粒型肺癌的相關(guān)因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的基線特征本研究共納入147 例EGFR 突變的NSCLC 患者，其中粟粒型肺癌組（A組）患者49 例，非粟粒型肺癌組（B 組）患者98 例。A組患者的中位年齡58歲，范圍為25 ～82歲。B患者的中位年齡63 歲，范圍為33 ～83 歲。A 組患者病理類型均為腺癌，B 組有96 例腺癌（98.0%），2例鱗癌（2.0%）。所有患者在接受治療前進(jìn)行基因檢測。A組中1例患者治療前檢測到合并T790M 突變，B 組1 例患者合并T790M 突變，2 例PI3K 復(fù)制，1 例HER2 擴(kuò)增，1 例ALK+突變，1 例ROS1 突變。所有患者的基線臨床資料平衡，兩組患者之間的年齡、性別、吸煙情況等基線特征差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），但兩組的EGFR 突變分型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的臨床病理基線特征Tab.1 Clinicopathological baseline characteristics of patients in both groups例（%）

2.2 腫瘤微環(huán)境中PD-L1 的表達(dá)及其對EGFRTKI 療效的影響A 組和B 組患者PD-L1 表達(dá)的陽性率分別為40.82%（20/49）和24.49%（24/98），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.042）。A 組PD-L1陽性患者的中位PFS 為5.1 個(gè)月，明顯短于陰性患者的9.4 個(gè)月（P= 0.009）。B 組PD-L1 陽性和陰性患者的中位PFS 分別為7.0 和11.0 個(gè)月，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024），見圖1。

2.3 腫瘤微環(huán)境的免疫分型及其與EGFR-TKI療效的關(guān)系既往文獻(xiàn)報(bào)道［10］，根據(jù)PD-L1 和CD8的表達(dá)狀態(tài)，將腫瘤微環(huán)境分為4 種類型：Ⅰ型（PD-L1+/CD8+，適應(yīng)性免疫抵抗）、Ⅱ型（PD-L1-/CD8-，免疫忽視）、Ⅲ型（PD-L1+/CD8-，內(nèi)源性誘導(dǎo)）和Ⅳ型（PD-L1-/CD8+，免疫耐受）。A 組Ⅰ型免疫微環(huán)境的患者有12 例，占比24.49%，B 組有10 例，占比10.20%，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.022）見圖2。A 組中I 型免疫微環(huán)境患者的中位PFS 為5.7 個(gè)月，其他型（Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型）患者的中位PFS 為7.4 個(gè)月，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.024）；B 組Ⅰ型微環(huán)境患者的中位PFS 為6.0 個(gè)月，其他型（Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型）患者的中位PFS 為11.0 個(gè)月，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.027），見圖3、4。

圖1 腫瘤微環(huán)境中PD-L1 表達(dá)陽性和陰性患者的無進(jìn)展生存曲線Fig.1 Progression-free survival curves of patients with positive and negative PD-L1 expressionin tumor microenvironment

圖2 粟粒型肺癌組和非粟粒型肺癌組患者的腫瘤微環(huán)境免疫表型比較Fig.2 Comparison of tumor microenvironmental immunophenotypes between miliary and non-miliary lung cancer group

3 討論

圖3 腫瘤微環(huán)境免疫表型與EGFR-TKI 療效的關(guān)系Fig.3 The relationship between tumor microenvironmental immunophenotype and the efficacy of EGFR-TKI

圖4 腫瘤微環(huán)境免疫表型不同患者的無進(jìn)展生存曲線Fig.4 Progression-free survival curves of patients with different tumor microenvironmental immunophenotypes

粟粒型肺癌患者是一類特殊的肺癌人群，有研究顯示，其EGFR 突變率較高，接近80%左右［2］。部分研究報(bào)道，這類型肺癌患者接受EGFR-TKI治療的療效可能不佳［2，6］，但影響其療效的因素尚未明確。T790M 突變、C-MET 擴(kuò)增以及組織學(xué)類型轉(zhuǎn)化是目前已知最常見的EGFR-TKI 的耐藥機(jī)制［13-14］，少數(shù)研究提出，腫瘤免疫微環(huán)境可能也參與了EGFR-TKI 的耐藥［11-12，15］。本研究通過大樣本量的回顧性分析，首次探討了粟粒型肺癌患者的免疫微環(huán)境及其與EGFR-TKI 療效的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，粟粒型肺癌的PD-L1 呈高表達(dá)狀態(tài)，“炎癥型”免疫微環(huán)境的比例較高，且呈炎癥型免疫微環(huán)境的患者接受EGFR-TKI 治療的療效較其他類型的免疫微環(huán)境差，提示炎癥型免疫微環(huán)境可能是粟粒型肺癌患者靶向治療療效差的原因，且該部分患者可能從免疫治療中獲益。

有研究顯示，EGFR 信號(hào)可通過激活ERK、AKT-mTOR、STAT3 通路上調(diào)PD-L1 的表達(dá)［16-17］。但免疫表型與EGFR 狀態(tài)的關(guān)系尚未完全清楚。MATSUMOTO 等［11］和LIU 等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR陽性NSCLC 患者Ⅰ型免疫微環(huán)境分別占13.5%和5%，均為四種免疫表型中最低的。與以往的研究結(jié)果相似，本研究中非粟粒型肺癌患者亦為Ⅰ型免疫表型最少（10.2%），然而粟粒型肺癌患者達(dá)到24.49%，顯著高于非粟粒型肺癌患者。目前粟粒型肺癌呈炎癥型免疫微環(huán)境的原因尚不明確，可能與肺癌的血行轉(zhuǎn)移或PD-L1 表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究來闡明。

越來越多的證據(jù)表明，免疫因素與EGFR-TKI的耐藥密切相關(guān)［12，19］。ZHANG 等［20］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PD-L1 可能通過激活TGF-β/Smad 通路誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），從而促進(jìn)EGFR-TKI 的原發(fā)耐藥。目前多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者EGFRTKI 療效不佳與PD-L1 的陽性表達(dá)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PD-L1 陽性表達(dá)的肺癌患者PFS 顯著縮短，與既往研究結(jié)果一致。

LIU 等［18］通過大樣本量的研究分析了EGFR突變或ALK 重排患者的PD-L1 表達(dá)和CD8+TILs 的狀態(tài)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合CD8+TILs 比單獨(dú)的PD-L1 表達(dá)更能預(yù)測肺腺癌患者的預(yù)后。TENG等［9］基于PD-L1 的表達(dá)與CD8+TILs 的狀態(tài)將腫瘤微環(huán)境分為四種免疫表型。MATSUMOTO 等［11］分析了四種不同腫瘤微環(huán)境免疫表型與EGFR-TKI療效的相關(guān)性，結(jié)果提示，Ⅰ型腫瘤微環(huán)境的PFS在四種類型中最短。前期研究也發(fā)現(xiàn)［12］，EGFRTKI 原發(fā)性耐藥患者的PD-L1/CD8 雙陽性表達(dá)比例較高，因此推測PD-L1 和CD8+TILs 表達(dá)可能與EGFR-TKI 耐藥相關(guān)。本研究納入了晚期EGFR 突變且接受EGFR-TKI 治療的49 例粟粒型肺癌和98 例非粟粒型肺癌患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組患者中呈Ⅰ型腫瘤微環(huán)境的患者PFS 均短于其他類型的患者，進(jìn)一步驗(yàn)證了Ⅰ型腫瘤微環(huán)境參與了EGFR-TKI 的耐藥。本研究進(jìn)一步對比了粟粒型肺癌與非粟粒型肺癌免疫微環(huán)境的差異，結(jié)果顯示，粟粒型肺癌患者呈Ⅰ型腫瘤微環(huán)境的比例顯著高于非粟粒型肺癌患者（24.49%vs. 10.20%，P=0.022）。因此推測免疫微環(huán)境可能是影響粟粒型肺癌接受EGFR-TKI 治療療效的重要因素，且這類患者出現(xiàn)EGFR-TKI 耐藥后可能受益于免疫治療。但是粟粒型肺癌、免疫微環(huán)境與EGFR-TKI 耐藥之間相互作用的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究來探索和驗(yàn)證。

本研究仍存在一些局限性。一方面，本研究為回顧性的單中心研究設(shè)計(jì)，可能存在選擇偏倚。另一方面，本研究未對EGFR-TKI 耐藥后的粟粒型肺癌患者進(jìn)行下一代基因測序，因此，難以明確是否存在其他未知的潛在的耐藥機(jī)制影響了EGFR-TKI 的療效，也無法從免疫信號(hào)通路方面，深入研究免疫因素影響EGFR-TKI 耐藥的分子機(jī)制。

綜上所述，本研究表明炎癥型免疫微環(huán)境可能是影響粟粒型肺癌患者EGFR-TKI 的療效不佳的原因之一。因此，免疫治療或是粟粒型肺癌EGFR-TKI 耐藥后的可選擇的治療策略。