湯樣華 楊振杰 莫亞峰 任國(guó)華 侯橋 辛大偉 曾林如

[摘要] 目的 觀察益腎除痹方對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β、INF-γ的影響。 方法 選擇24只類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物對(duì)照組、益腎除痹方低劑量組、益腎除痹方高劑量組，每組各6只，另取6只大鼠為空白組（正常組）。藥物連續(xù)干預(yù)4周，于第2、4周，取大鼠血清及進(jìn)行關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞培養(yǎng)，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清及關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量。 結(jié)果 模型組大鼠血清及滑膜細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量均高于空白組（P<0.05）。陽性藥物對(duì)照組和益腎除痹方高劑量組大鼠血清及滑膜細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量均明顯低于模型組（P<0.05）;而益腎除痹方低劑量組中除第2周所取血清中的TNF-α、IFN-γ和滑膜細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余均明顯低于模型組（P<0.05）。 結(jié)論 益腎除痹方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制與降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的水平有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 益腎除痹方;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;炎癥因子;作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R245.81;R593.21? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? &nbsp; ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）35-0027-05

Impacts of Yishen Chubi Prescription on inflammatory factors TNF-α， IL-1β and INF-γ in serum and joint synovial cells of rats with rheumatoid arthritis

TANG Yanghua? ?YANG Zhenjie? ?MO Yafeng? ?REN Guohua? ?HOU Qiao? ?XIN Dawei? ?ZENG Linru

Department of Orthopedics， Xiaoshan Hospital of Traditional Chinese Medicine in Hangzhou， Jiangnan Hospital Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou? ?311201， China

[Abstract] Objective To observe the impacts of Yishen Chubi Prescription on inflammatory factors TNF-α， IL-1β and INF-γ in serum and joint synovial cells of rats with rheumatoid arthritis. Methods A total of 24 rats with rheumatoid arthritis were randomly divided into the model group（n=6）， the positive drug control group （n=6）， the low-dose Yishen Chubi prescription group（n=6） and the high-dose Yishen Chubi Prescription group（n=6）. Other rats were selected as the blank group （the normal group， n=6）. Drug intervention continued for 4 weeks. In the second and fourth week， rat serum and synovial cells were collected and cultured. And the contents of TNF-α， IL-1β and INF-γ in rat serum and synovial cells were detected by ELISA method. Results The contents of TNF-α， IL-1β and IFN-γ in rat serum and synovial cells of the model group were all higher than those of the blank group（P<0.05）. The contents of TNF-α， IL-1β and IFN-γ in rat serum and synovial cells in the positive drug control group and the high-dose Yishen Chubi prescription group were all significantly lower than those in the model group（P<0.05）. However， there were no statistically significant differences between TNF-α， IFN-γ in serum and TNF-α， IL-1β in synovial cells of the second week in the low-dose Yishen Chubi prescription group and those in the model group. Except for this， the rest indices were all significantly lower than those in the model group（P<0.05）. Conclusion The mechanism of function of Yishen Chubi Prescription in the treatment of rheumatoid arthritis is related to reducing the levels of inflammatory factors TNF-α， IL-1β and IFN-γ.

[Key words] Yishen Chubi Prescription; Rheumatoid arthritis; Inflammatory factors; Mechanism of function

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種較為常見的自身免疫性疾病，疾病發(fā)展后具有較高的致殘性，并嚴(yán)重影響患者的生活和日常工作[1]。因RA致病因素及病理機(jī)制復(fù)雜多變，臨床尚無特效治療藥物，目前也多采用聯(lián)合用藥治療，以提高臨床療效[2-3]，但同時(shí)或多或少也存在藥物副作用。因此，如何提高療效，并降低RA致殘率及藥物副作用，改善患者生活質(zhì)量，仍是當(dāng)前臨床治療及研究的重點(diǎn)。中醫(yī)藥在RA的臨床治療有悠久的歷史，且具有確切的療效。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，RA其本在腎，其標(biāo)在氣血，腎藏精、主骨，腎精旺盛，則筋骨得養(yǎng)而關(guān)節(jié)滑利，腎虛則精髓不足，無以養(yǎng)骨，臟腑功能失調(diào)，引起氣血失和、津液運(yùn)行失調(diào)，阻滯經(jīng)絡(luò)，導(dǎo)致RA發(fā)生[4]。據(jù)此病機(jī)，前期我科臨床上應(yīng)用自擬益腎除痹方加減治療RA，并取得較好的療效，但相關(guān)作用機(jī)制尚不明確。目前TNF-α、IL-1、INF-γ是RA發(fā)病機(jī)制中主要的核心炎癥細(xì)胞因子[5-7]?；诖?，本研究通過使用弗氏完全佐劑（FCA）誘導(dǎo)法建立RA大鼠模型，并進(jìn)行藥物干預(yù)，旨在觀察益腎除痹方對(duì)大鼠RA 模型血清及關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β、INF-γ水平的影響，進(jìn)一步探討益腎除痹方對(duì)RA的療效和作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠30只，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。每天光照、黑暗各12 h規(guī)律交替飼養(yǎng)，室溫25℃，濕度60%～70%。所有動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。

1.2 主要試劑與儀器

益腎除痹方顆粒（藥物組成：地黃10 g、山萸肉10 g、山藥10 g、淫羊藿12 g、露蜂房6 g、制川烏5 g、半夏10 g、白芥子6 g、薏苡仁30 g、海風(fēng)藤25 g、桂枝10 g、防己10 g，由杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院中藥顆粒劑藥房提供），完全弗氏佐劑（德國(guó)Sigma公司），雷公藤多苷片（浙江得思德制藥有限公司），IL-1β、TNF-α、TGF-β試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司），Citrate檸檬酸鹽緩沖液、PBS磷酸鹽緩沖液（北京百奧思科生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司），生化培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司），全自動(dòng)脫水機(jī)、水浴缸、正置熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），電子天平（上海花潮實(shí)業(yè)有限公司），加熱磁力攪拌器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），微量加樣器（德國(guó)Physiocare concept公司）。

1.3 造模與分組

使用弗氏完全佐劑（FCA）誘導(dǎo)法建立RA大鼠模型，具體方法：于左后腳底區(qū)注射0.1 mL完全弗氏佐劑，在注射的第1天，記錄大鼠體重及左后腳掌體積，隨后用體積描記器測(cè)量非注射腳掌的體積。在第21天時(shí)再次稱重，并觀察和根據(jù)評(píng)分分級(jí)評(píng)價(jià)繼發(fā)性病變的嚴(yán)重程度：①耳朵：無小結(jié)、不紅，計(jì)0分;有小結(jié)、色紅，計(jì)1分。②鼻：結(jié)締組織不腫脹，計(jì)0分;結(jié)締組織嚴(yán)重腫脹，計(jì)1分。③尾：無小結(jié)，計(jì)0分;有小結(jié)，計(jì)1分。④前爪：無關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，計(jì)0分;至少一個(gè)關(guān)節(jié)出現(xiàn)有炎癥表現(xiàn)，計(jì)1分。⑤后爪：無關(guān)節(jié)出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，計(jì)0分;關(guān)節(jié)表現(xiàn)為輕度炎癥，計(jì)1分;中度炎癥，計(jì)2分;嚴(yán)重炎癥，計(jì)3分。繼發(fā)反應(yīng)達(dá)峰值時(shí)，對(duì)各組大鼠分別按上述分級(jí)評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)分結(jié)果采用雙樣本異方差t檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析，當(dāng)大鼠各部位評(píng)分均表現(xiàn)為顯著差異時(shí)，表明造模成功。無非常顯著差異或只出現(xiàn)前足、耳、尾繼發(fā)反應(yīng)，均屬淘汰樣本。選擇造模成功的24只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物對(duì)照組、益腎除痹方低劑量組、益腎除痹方高劑量組，每組各6只。另取6只大鼠為空白組（正常組）。

1.4 方法

于造模成功后第2天分別給予藥物干預(yù)，藥物等效劑量根據(jù)大鼠體重及體表面積計(jì)算給藥劑量，陽性藥物對(duì)照組給予雷公藤多苷12 mg/（kg·d）灌胃;益腎除痹方顆粒1倍等效劑量為1.672 g/（kg·d），益腎除痹方低劑量組、益腎除痹方高劑量組每日予3 mL益腎除痹方顆粒溶液灌胃，劑量分別為1 倍等效劑量和2倍等效劑量;空白組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃;連續(xù)4周。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量? 藥物干預(yù)后第2、4周，每組各取3只大鼠，使用抗凝管采集大鼠尾部靜脈血5 mL，3500 r/min離心15 min，分離血清。試劑盒取出后在室溫復(fù)溫平衡20 min，蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。取酶標(biāo)包被板固定于框架上，并分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50 μL標(biāo)準(zhǔn)品;待測(cè)樣本孔中先加入10 μL待測(cè)樣本后，再加入40 μL樣本稀釋液;空白對(duì)照孔不加。然后在標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔中每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體（空白孔除外），并用封版膜封住反應(yīng)孔，然后在37℃水浴鍋溫育 60 min后棄液，吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次后，先后在每孔加入顯色劑 A液、B液各50 μL，用手輕輕震蕩混勻 30 s，37℃避光顯色 15 min后取出酶標(biāo)板，終止反應(yīng)后，讀取酶標(biāo)儀上450 nm 處吸光度值。

1.5.2 ELISA檢測(cè)大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量? 藥物干預(yù)后第2、4周，斷頭處死大鼠，每組各3只，完整剝離踝關(guān)節(jié)滑膜組織，滑膜組織D-hanks緩沖液洗滌3遍后用眼科剪剪成2～3 mm3的小塊，分別加入1 mL含15%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液和0.2%膠原酶后，移入25 cm2培養(yǎng)瓶并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，消化2.5 h后反復(fù)吹打，將未粘附的細(xì)胞移入離心管，1000 r/min離心10 min后棄上清液，加入4 mL的0.25%胰蛋白酶，然后移入25 cm2培養(yǎng)瓶并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，消化30 min后去上清。將分離的滑膜細(xì)胞使用無D-hanks緩沖液沖洗3遍后重懸于含15%的小牛血清DMEM培養(yǎng)液中。然后采用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其活力是否大于95%和Giemsa染色，高倍鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞，觀察其純度是否在95%以上。根據(jù)所檢測(cè)的濃度合格細(xì)胞用上述DMEM配制成滑膜細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液濃度為5×105/L，將細(xì)胞懸液按每孔1 mL分別加入24孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h，800 r/min離心10 min后收集上清，然后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，濾過液置于-40℃保存。試劑盒從冰箱取出后在室溫下復(fù)溫平衡20 min，將蒸餾水濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。取酶標(biāo)包被板固定于框架上，并分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位置。在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入 50 μL標(biāo)準(zhǔn)品;待測(cè)樣本孔中先加入10 μL待測(cè)樣本后，再加入40 μL樣本稀釋液;空白對(duì)照孔不加。然后在標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔中每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體（空白孔除外），并用封版膜封住反應(yīng)孔，然后在37℃水浴鍋溫育 60 min后棄液，吸水紙上拍干。每孔加滿洗滌液，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次，先后在每孔加入顯色劑 A 液、B 液 各50 μL，用手輕輕震蕩混勻 30 s，37℃避光顯色 15 min后取出酶標(biāo)板，終止反應(yīng)后，讀取酶標(biāo)儀上450 nm 處吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量比較

模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均明顯高于空白組（P<0.05）。與模型組相比，給藥各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有降低趨勢(shì)，其中陽性藥物對(duì)照組血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有顯著性降低（P<0.05）;益腎除痹方低劑量組中除第2周所取血清中TNF-α與IFN-γ僅有輕度下降外，其余均顯著降低（P<0.05）;而益腎除痹方高劑量組第2周和第4周血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有顯著性下降（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β、INF-γ的含量比較

模型組大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均高于空白組（P<0.05）。與模型組相比，給藥各組大鼠滑膜細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有下降趨勢(shì);其中陽性藥物對(duì)照組和益腎除痹方高劑量組大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均顯著下降（P<0.05）。益腎除痹方低劑量組，除給藥第2周所取滑膜細(xì)胞中TNF-α與IL-1β，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余均顯著下降（P<0.05）。見表2。

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，并存在不同程度的關(guān)節(jié)功能障礙，常給患者的生活及工作帶來較大的負(fù)面影響。隨著人口老齡化和生活方式的改變，RA發(fā)病率也逐漸增長(zhǎng)[8]。盡管目前對(duì)RA有較深入的研究，但對(duì)RA的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，并存在一定分歧。當(dāng)前，炎癥因子被公認(rèn)為RA的主要致病因素，是炎癥、感染和免疫性疾病的重要介質(zhì)，是存在于細(xì)胞外的一組小分子多肽，主要由單核/巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的一系列炎癥單核因子，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。在RA的急性滑膜炎癥、滑膜纖維化、骨與軟骨破壞等病理改變中炎癥單核因子起重要作用[9]，其中IL-1（尤其是IL-1β）、TNF-α和IFN-γ起主導(dǎo)作用地位，并均由單核/巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生。以往已有眾多研究[10-12]表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的外周血中單核細(xì)胞及關(guān)節(jié)滑膜液中的巨噬細(xì)胞，均能分泌產(chǎn)生IL-1、TNF-α、IFN-γ，并誘發(fā)外周血、關(guān)節(jié)滑液中的IL-1、TNF-α、IFN-γ水平升高。本研究采用弗氏完全佐劑誘導(dǎo)法建立RA大鼠模型，通過ELISA法檢測(cè)大鼠血清和關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型組大鼠血清及滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有顯著性升高（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)TNF-α、IL-1β、IFN-γ仍然是RA的主要炎癥因子。

有研究[13-14]報(bào)道，在對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)炎癥部位的持續(xù)性細(xì)胞浸潤(rùn)和誘導(dǎo)組織破壞，IL-1、TNF-α起著更為直接的作用，并認(rèn)為是發(fā)生骨質(zhì)吸收、破壞以及關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要炎癥細(xì)胞因子，其中與IL-1的作用更為密切。深入研究發(fā)現(xiàn)IL-1比TNF-α、IFN-γ更容易引起軟骨和骨損傷[15]。因此，阻斷IL-1、TNF-α、IFN-γ炎癥因子對(duì)控制關(guān)節(jié)損傷至關(guān)重要，并可能是RA很好的治療目標(biāo)[16-17]。由于對(duì)RA的具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，目前西醫(yī)治療 RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等，盡管能緩解病情，但不良反應(yīng)也頗多。因此，深入研究RA的發(fā)病機(jī)制，尋求新的治療藥物，具有重要醫(yī)學(xué)價(jià)值。而且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也認(rèn)為單一用藥時(shí)藥物作用靶點(diǎn)單一，不僅易產(chǎn)生耐藥性，而且副作用也更為明顯，而復(fù)方藥物則具有多層次、多靶點(diǎn)療效等特點(diǎn)[18]。益腎除痹方為我科治療RA的自擬中藥復(fù)方，具有補(bǔ)肝腎，祛風(fēng)濕，通絡(luò)止痛的功效，前期臨床應(yīng)用療效確切，且副作用小，但其具體作用機(jī)制尚不明確。基于以上論述，本研究通過觀察益腎除痹方對(duì)RA大鼠血清及滑膜細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量水平的影響，探討其治療RA的相關(guān)作用機(jī)制，以期為臨床推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，益腎除痹方低劑量組中除第2周所取血清中TNF-α與IFN-γ僅有輕度下降外，其余均顯著降低（P<0.05）;而益腎除痹方高劑量組第2 周和第4周血清中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量均有顯著下降（P<0.05）。另外，益腎除痹方高劑量組大鼠滑膜細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IFN-γ的含量也均顯著下降（P<0.05）;益腎除痹方低劑量組，除給藥第2周所取滑膜細(xì)胞中TNF-α與IL-1β差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余也均顯著下降（P<0.05），提示益腎除痹方治療RA的作用與降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平相關(guān)。

綜上所述，益腎除痹方治療RA的作用機(jī)制與降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ的水平有關(guān)。

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（收稿日期：2020-12-17）

[基金項(xiàng)目] 浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃項(xiàng)目（LGF20H060001）;浙江省杭州市科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目（20181228Y84）