漆永紅 李敏權(quán) 曹素芳 蔣晶晶 李雪萍 李青青 徐美蓉 李繼平

摘要：為明確黨參莖基腐病害的病原、致病性和優(yōu)勢病原種類及其對不同殺菌劑的敏感性，采用組織分離法進行病原菌分離，并根據(jù)其培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征進行鑒定，同時采用平皿菌絲生長抑制法測定不同藥劑的敏感性。結(jié)果表明，該病害的病原為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、茄病鐮孢菌（F. sonali）和木賊鐮孢菌（F. equiseti），其中尖孢鐮孢菌為優(yōu)勢種。室內(nèi)致病性測試結(jié)果表明，3種鐮孢菌均可引起黨參莖基腐病，其中尖孢鐮孢菌的致病性最強，顯著高于其他2種菌。供試藥劑對菌絲生長均有抑制作用，苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮孢菌具有很強的抑制活性，同時3種鐮孢菌對吡唑醚菌酯的敏感性較高。

關(guān)鍵詞：黨參；莖基腐??；鐮孢菌；病原鑒定；殺菌劑；敏感性測定

中圖分類號：S436.429文獻標志碼：A論文編號：cjas2020-0052

Identification of Codonopsis pilosula Crown Rot Disease and Its Sensitivity to Fungicides

Qi Yonghong1， Li Minquan2， Cao Sufang2， Jiang Jingjing1， Li Xueping1， Li Qingqing1， Xu Meirong3， Li Jiping1

（1Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China；

2Institute of Fruit and Floriculture Research， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China； 3Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： To clarify the pathogen， pathogenicity and dominant pathogen species of Codonopsis pilosula crown rot disease and their sensitivity to different fungicides， the pathogen was isolated by tissue isolation method and identified according to its culture traits， morphology and molecular biological characteristics. Meanwhile， the sensitivity of different fungicides was determined by mycelium growth inhibition method. The results showed that the disease pathogens were identified as Fusarium oxysporum， F. sonali and F. equiseti. The dominant species was F. oxysporum. Pathogenicity testing showed that the three species could cause C. pilosula crown rot disease， F. oxysporum had the strongest pathogenicity， and its disease rate and disease index had a significant difference from those of the other two. Laboratory toxicity test of different fungicides to the mycelia growth of the three species showed that difenoconazole fungicide had the strongest inhibition activity， and the three Fusarium species had the highest sensitivity to pyraclostrobin fungicide.

Keywords： Codonopsis pilosula； Crown Rot Disease； Fusarium spp.； Pathogen Identification； Fungicides； Sensitivity Testing

0引言

黨參（Codonopsis pilosula）為桔?？泣h參屬，多年生草本植物，產(chǎn)自中國北方海拔1560～3100 m的山地林邊及灌叢中。黨參為中國常用的傳統(tǒng)補益藥，具有補中益氣、健脾益肺的功效，主要有增強免疫力、擴張血管、降壓、改善微循環(huán)、增強造血功能等作用[1]。根據(jù)外形和產(chǎn)地不同，黨參分為西黨、潞黨、東黨和條黨[2]。甘肅省渭源縣是中國黨參之鄉(xiāng)，主要生產(chǎn)白條黨參。隨著黨參人工栽培面積的逐年擴大，生長環(huán)境的改變和病原菌的不斷積累，病害已成為制約黨參產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一。

國內(nèi)一些學(xué)者對黨參的病害進行了研究。王艷等[3]報道甘肅省渭源和隴西縣黨參病害有斑枯病（Septoriacodonopsidis）、白粉病（Sphaerotheca codonopisi）、灰霉病（Botrytis cinerea）和根腐?。‵usarium oxysporiums）共4種。何先元等[4]研究發(fā)現(xiàn)，川黨的根腐病（Fusarium sp.）、銹?。≒uccinia campanumoeae）、紫紋羽?。℉elicobasidium mompa）和霜霉病（Peronospora corydalis）等病害嚴重影響了其品質(zhì)和產(chǎn)量。劉春葉等[5]對洛黨參白粉病、銹病和根腐病的田間發(fā)生動態(tài)進行了調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銹病發(fā)生最早。余中蓮等[6]研究表明，川黨參主要病害有銹病、根腐病、紫紋羽病、白粉病和斑枯病共5種，其中銹病、根腐病和紫紋羽病發(fā)生嚴重。近年來，黨參莖基腐病在甘肅省黨參種植區(qū)普遍發(fā)生，為害面積逐年呈上升趨勢，尤其以重茬黨參發(fā)病嚴重[7]。據(jù)調(diào)查，一般田間發(fā)病率為5%～10%，嚴重的達30%以上，該病害已成為制約當?shù)攸h參發(fā)展的主要因素之一，嚴重影響了黨參的產(chǎn)量與品質(zhì)，給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟損失[8]。關(guān)于該病害在甘肅省定西市臨洮縣、渭源縣、岷縣等地的病原種類等未見報道，故本研究擬對定西市發(fā)生的黨參莖基腐病的發(fā)生癥狀進行研究，以確定其病原、致病性及其優(yōu)勢種群，同時進行室內(nèi)藥劑篩選及敏感性測定，初步篩選出化學(xué)防治的最佳藥劑，為黨參莖基腐病的田間防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病樣采集與病原菌分離和純化

2018年6月在甘肅省定西市臨洮縣、渭源縣、岷縣等主要黨參生產(chǎn)基地采集發(fā)病植株，裝入塑料袋帶回實驗室。采用常規(guī)組織分離法[9]，剪取莖基部病健交界處5 mm×5 mm組織塊在75%酒精中浸泡5 s，然后轉(zhuǎn)移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于PDA培養(yǎng)基平板內(nèi)于25℃培養(yǎng)5～7天。從菌落邊緣切取菌絲塊置于香石竹葉片瓊脂（CLA）培養(yǎng)基（瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，每皿加入長度1 cm的無菌康乃馨葉片3片），在25℃培養(yǎng)7～10天。將分離純化的菌株轉(zhuǎn)接至PDA斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2致病性測定

采用牙簽刺接種法，將滅菌的牙簽放在帶菌的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使牙簽上布滿菌絲；用帶菌牙簽穿刺黨參‘隴黨1號’幼苗莖部，無菌土掩埋接種部位，每菌接種15株黨參幼苗，以無菌牙簽穿刺黨參幼苗作為對照（CK），接種30天后觀察黨參的發(fā)病情況，統(tǒng)計發(fā)病率。病情指數(shù)根據(jù)分級標準進行測定：0級，莖基部沒有病斑；1級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占5%；3級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占10%；5級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占25%；7級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占50%以上。

1.3病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌分別接種在PDA和CLA培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7天和10天后，觀察并拍照記錄菌落形態(tài)、顏色、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與分生孢子形態(tài)、大小，根據(jù)鐮孢菌分類方法和標準進行病原菌種類鑒定[10]。

1.4病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1真菌基因組DNA提取刮取PDA培養(yǎng)基上的病原菌菌絲，采用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒E.Z. N.ATM.HP Fungal DNA Kit（OMEGA）的方法提取DNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2分子鑒定的引物本試驗用真菌通用引物和鐮孢菌特異性引物[11- 12]，通用引物F1和F2的序列分別為ATTACTCCAGCATCCTTGC、TTTACAACTCCCAAA CCCC；核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）ITS1和ITS4的序列分別為TCCGTAGGTGAACCTGCGG、TCCTCCGCTTATTG ATATGC；鐮孢菌特異性引物TEF1αF和TEF1αR的序列分別為ATGGGTAAGGARGACAAGAC、GGARGT ACCAGTSATCATGTT。

1.4.3 PCR擴增PCR擴增體系（25μL）：10×Buffer2.5μL、2.5 mol/L dNTP 4μL、10μmol/L正反向引物各1μL、Taq酶0.5μL、DNA模板1μL，用ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，25個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃冰箱保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將獲得的序列與GenBank核酸序列庫進行同源性比對分析。

1.5病原菌對藥劑的敏感性測定

供試藥劑及濃度：10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（山東惠民中聯(lián)生物科技有限公司），濃度為500、250、125、62.5、31.25μg/mL；250 g/L丙環(huán)唑乳油（中國農(nóng)科院植保所農(nóng)藥廠），濃度為800、400、200、100、50μg/mL；70%代森錳鋅可濕性粉劑（四川國光農(nóng)化有限公司），濃度為1000、500、250、125、62.5μg/mL；25%吡唑醚菌酯懸浮劑（山東惠民中聯(lián)生物科技有限公司），濃度為1000、500、250、125、62.5μg/mL；430 g/L戊唑醇懸浮劑（永農(nóng)生物科技有限公司），濃度為600、300、150、75、37.5μg/mL。

采用常規(guī)菌絲生長抑制法測定供試藥劑對病原菌的敏感性。在DNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3種真菌，打取0.5 cm菌餅，將其移到含有不同藥劑濃度的PDA培養(yǎng)基上，每種藥設(shè)5個濃度，以無藥處理作對照。25℃培養(yǎng)5天后，十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率。采用唐啟義和馮明光[13]的實用統(tǒng)計分析及其DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件，用生物測定-數(shù)量型數(shù)據(jù)機率值分析模型計算藥劑的毒力回歸方程y=a+bx、EC50和相關(guān)系數(shù)r，同時由平均b值確定不同病原菌對藥劑的敏感性。

2結(jié)果與分析

2.1黨參莖基腐病發(fā)病癥狀

黨參地上部的部分葉片變黃，植株由下而上變黃枯死?？拷孛娓喜康那o基部受害后，起初產(chǎn)生紅色的類似“鐵銹”病斑，逐漸變?yōu)楹稚梁诤稚“?，最后蔓延到整個莖部（圖1）。

2.2病原菌在田間的分布及種類鑒定

共采集到黨參標樣52份，室內(nèi)分離到鐮孢菌株328株。3種鐮孢菌在每個縣區(qū)均有分布，對分離到的菌株進行鑒定和統(tǒng)計，尖孢鐮孢菌217株，占66.16%；茄病鐮孢菌和木賊鐮孢菌為63株和48株，分別占19.20%和14.64%；其中尖孢鐮孢菌為黨參莖基腐病的優(yōu)勢種群。

各病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征鑒定如下：（1）菌株編號HX-2-3-3-1尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）。在 PDA培養(yǎng)基上菌落白色、粉色至紫色。大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細，具3～5個橫隔膜，多為3個隔，大小為（23.5～32.9）μm×（2.4～3.5）μm，足胞明顯。小型分生孢子橢圓形、長橢圓形，單胞，無色，假頭狀，大小為（3.5～14.1）μm×（1.8～2.9）μm。

（2）菌株編號WDCJ- 1- 1- 1茄病鐮孢菌（F. sonali）。在PDA培養(yǎng)基上菌落淡藍色，菌表白色，較繁茂或致密。大型分生孢子無色、淡綠色，較寬，兩端圓，馬特型，2～5個隔膜，多為3個隔膜，大小為（21.2～37.6）μm×（3.9～4.8）μm。小型分生孢子單胞，橢圓形、腎形，無色，大小為（7.1～14.1）μm×（2.9～4.1）μm。

（3）菌株編號MCJ-2-1-1木賊鐮孢菌（F. equiseti）。氣生菌絲棉絮狀，多數(shù)菌株后期變黃褐色。大型分生孢子鐮孢形，頂細胞延長漸細，足細胞明顯，3～5個分隔，大小為（26.0～52.5）μm×（3.0～5.0）μm。小型分生孢子，紡錘形或腎形。

2.3病原菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

測序結(jié)果與GenBenk數(shù)據(jù)庫中進行Nucleotide Blast比對，與該病原菌的ITS片段同源性達99%，其中尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）、茄病鐮孢菌（F. sonali）和木賊鐮孢菌（F. equiseti）的序列分別為543、546、596 bp。黨參莖基腐病與F. oxysporum、F. sonali和F. equiseti.親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將從甘肅省定西市臨洮縣、渭源縣、岷縣采集的黨參中分離得到的莖基腐病致病菌鑒定為尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）、茄病鐮孢菌（F. sonali）和木賊鐮孢菌（F. equiseti）。

2.4 3種鐮孢菌對黨參的致病性測定結(jié)果

與對照相比，尖孢鐮孢菌、茄病鐮孢菌和木賊鐮孢菌均對黨參有致病性，但發(fā)病率和病情指數(shù)不同（表1）。尖孢鐮孢菌的致病性最強，發(fā)病率和病情指數(shù)最高，分別為92.0%和45.2，顯著高于茄病鐮孢菌和木賊鐮孢菌（P<0.05），而茄病鐮孢菌和木賊鐮孢菌對黨參的致病力較弱，兩者差異不顯著。

2.5不同病原菌對殺菌劑的敏感性測定結(jié)果

各種藥劑在一定的濃度處理下均對3種鐮孢菌有抑制作用，隨著處理濃度的增加，抑制效果增加。不同藥劑對3種鐮孢菌的半致死中濃度EC50值不同，其中苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮孢菌的EC50值最小，戊唑醇次之，而代森錳鋅最高，表明苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮孢菌具有很強的抑制活性（表2）。從毒力回歸方程可以看出，各藥劑在不同鐮孢菌中的b值不同。吡唑醚菌酯的b值最大，戊唑醇次之，而苯醚甲環(huán)唑的b值最小。經(jīng)統(tǒng)計分析，吡唑醚菌酯與苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、代森錳鋅相比差異顯著，而苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、代森錳鋅和戊唑醇四者之間差異不顯著，表明3種鐮孢菌對吡唑醚菌酯的敏感性較高（表3）。

3討論與結(jié)論

植物病害病原種類的確定是防治的前提和基礎(chǔ)，明確病原種類對制定合理的防治策略和提高防治效果有重要的指導(dǎo)作用[14]。本試驗首次開展了甘肅省黨參莖基腐病害研究，初步明確了該病害的病原為尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）、茄病鐮孢菌（F. sonali）和木賊鐮孢菌（F. equiseti），其中尖孢鐮孢菌為優(yōu)勢種，這表明黨參莖基腐病病原種類復(fù)雜，存在多種鐮孢菌復(fù)合侵染的現(xiàn)象，因此不難想象田間黨參莖基腐病為害的普遍性和嚴重性。

尖孢鐮孢菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中危害最嚴重的土傳病原物之一，具有很強的寄生和腐生能力，其致病機制[15]為：（1）尖孢鐮孢菌產(chǎn)生毒素鐮孢菌酸對寄主植物抵抗力的降低和對寄主植物細胞代謝的影響[16-17]；（2）尖孢鐮孢菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶降解寄主植物的細胞壁防御和保護組織，致使寄主植物細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)釋放[18，19]；（3）尖孢鐮孢菌與寄主植物互作過程中產(chǎn)生一些蛋白物質(zhì)影響病原菌在寄主植物根部定植和萌發(fā)[20]；（4）尖孢鐮孢菌對寄主植物防衛(wèi)物質(zhì)解毒，使寄主植物失去防御機制[21]。本試驗僅明確了黨參莖基腐病的發(fā)病癥狀、不同鐮孢菌的種類和優(yōu)勢病原菌，但關(guān)于不同鐮孢菌和黨參莖基腐病的致病機理有待于進一步研究。

化學(xué)防治在鐮孢菌的防治中起到很重要的作用[22-23]。本試驗通過室內(nèi)藥劑生測篩選出苯醚甲環(huán)唑?qū)?種鐮孢菌具有很強的抑制活性，同時3種鐮孢菌對吡唑醚菌酯的敏感性較高，為黨參莖基腐病的田間防治提供理論依據(jù)。然而，在實際生產(chǎn)當中，長期用藥單一，病原菌對此類藥劑產(chǎn)生抗性，應(yīng)采取多種藥劑交替使用的方法來防治黨參莖基腐病。同時，對鐮孢菌這種土傳病原引起植株根部發(fā)病，選擇灌根藥劑的劑型應(yīng)具有雙向內(nèi)吸的特點，可針對不同劑型這一可控變量展開研究，篩選出防效更好的劑型。

由鐮孢菌引起的病害不僅通過化學(xué)方法，還可利用綜合方法解決，這是由于鐮孢菌是一種常見的土傳病原菌，可通過帶菌種子和種苗進行遠距離傳病，同時施用未腐熟糞肥加重病害發(fā)生[24]，這表明遏制病原菌傳播和施用充分腐熟的農(nóng)家肥是防治黨參莖基腐病最直接和最有效的農(nóng)業(yè)防治措施。此外，病原菌由傷口侵入植株后，迅速在植株的維管束內(nèi)繁殖，并堵塞導(dǎo)管，嚴重阻礙植株的物質(zhì)運輸，導(dǎo)致葉片黃化、萎蔫及枯死[25]，這表明徹底清除土壤中的螻蛄、蠐螬和地老虎等地下害蟲，以免其為害造成傷口，使病原菌更易從造成的傷口侵入加重莖基腐病的發(fā)生，這進一步說明在黨參移栽時，選擇無蟲感染、無機械損傷和表皮光滑健康種苗的重要性。

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