龐小蓮，劉吉成，林 生，周成忠，曾海清

（1.廣西壯族自治區(qū)玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西 玉林537000；2.廣西壯族自治區(qū)南寧市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧530007；3.廣西實(shí)正藥業(yè)有限公司，廣西 玉林537000）

中成藥走川骨刺酊由天南星、水半夏、草烏等7味藥材經(jīng)滲漉法提取而成，主要功效有活血祛瘀、通絡(luò)止痛，常用于瘀血阻滯所致骨痹（骨質(zhì)增生癥），癥見(jiàn)關(guān)節(jié)疼痛或刺痛，痛處固定，活動(dòng)不利，面色晦暗，唇舌紫暗，脈沉或細(xì)澀等。處方中主要藥材草烏的主要成分為二萜類生物堿，包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等，既是有效成分又是毒性成分［1］。產(chǎn)地、采收時(shí)間和炮制方法不同時(shí)，藥材毒性成分含量存在較大差異［2-4］。成人口服純?yōu)躅^堿0.2 mg即可引起中毒，3～5 mg可致死［5-8］。本品雖為外用，但使用過(guò)程中若有不慎即可引起中毒。目前含有烏頭類藥材中成藥的研究中，多數(shù)僅規(guī)定了烏頭堿的含量限度［9-10］。為了保證產(chǎn)品質(zhì)量及安全，本試驗(yàn)中采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法同時(shí)測(cè)定走川骨刺酊中3種烏頭類成分含量，為產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜儀，Waters Xevo TQ-S型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；LC/MS30-1-E型氮?dú)獍l(fā)生器（英國(guó)Domnick Hunter公司）；3K15型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；XS-205DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ-500GDV型恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

走川骨刺酊（廣西實(shí)正藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為201408101，201407101，201503101，201608101，201611101，201612101，201612102，201612103，201703101，201705101）；烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110798-201307，純度98.8%）、次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110720-201111，純度98.8%），新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)為110799-201106，純度98.4%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、甲酸均為色譜純，氨水、甲醇、鹽酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC? BEH C18柱［11］（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～4 min時(shí)90%A→60%A，4～4.5 min時(shí)60%A-90%A，4.5～6 min時(shí)90%A［11］；流速為0.25 mL/min［12］；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為35℃。

質(zhì)譜條件：離子源模式為電噴霧離子源（ESI）、正離子模式，掃描類型為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），毛細(xì)管電壓1.8 kV。離子源溫度為100℃，錐孔氮?dú)饬魉贋?50 L/h，碰撞氣為氬氣，脫溶劑氣氮?dú)饬魉贋?50 L/h，脫溶劑氣溫度為350℃，四極桿作為質(zhì)量分析器［13-14］。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表1［15］。

表1 3種烏頭類生物堿MRM參數(shù)Tab.1 MRM parameters of three kinds of aconitum alkaloids

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取烏頭堿對(duì)照品9.31 mg、次烏頭堿10.65 mg，精密稱定，各置25 mL容量瓶中，取新烏頭堿10.30 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，均用甲醇溶解并定容，得單一對(duì)照品貯備液；分別精密量取0.125 mL，置同一50 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得。

供試品溶液：精密量取樣品5 mL，用0.1 mol/mL鹽酸調(diào)pH至3，渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，過(guò)MCX柱（規(guī)格為500 mg/6 mL，上樣前用甲醇、超純水各5 mL活化），上樣液，先用5 mL 0.1 mol/mL鹽酸洗脫，再分別加水、甲醇各5 mL洗脫，棄去洗脫液，最后用0.5%氨化甲醇15 mL洗脫，收集洗脫液置50℃水浴下以氮?dú)獯抵两?，?.1%甲酸溶液-乙腈（90∶10，V/V）20 mL溶解，渦旋1 min，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）10 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容，即得供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置50 mL容量瓶中，用初始流動(dòng)相定容，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜濾過(guò)，即得。

陰性對(duì)照品溶液：按走川骨刺酊標(biāo)準(zhǔn)工藝，取走馬胎3.6 g，川芎3.2 g，紅杜仲、天南星、骨碎補(bǔ)、水半夏各2.6 g制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密量取2.2項(xiàng)下3種溶液，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿各峰分離良好，對(duì)照品溶液及供試品溶液目標(biāo)峰保留時(shí)間一致，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。MRM色譜圖見(jiàn)圖1至圖3。

線性關(guān)系考察：分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.010，0.025，0.050，0.100，0.250，0.500，1.000 mL，置10 mL容量瓶中，分別加初始流動(dòng)相定容，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程烏頭堿為Y1＝10 523.1X1＋12 880.9，r1＝0.997 8（n＝7），次烏頭堿為Y2＝10 970 X2＋10 392.7，r2＝0.997 4（n＝7），新烏頭堿為Y3＝12 118 X3＋2 699.81，r3＝0.999 8（n＝7）。結(jié)果表明，質(zhì)量濃度線性范圍烏頭堿為0.919 8～91.980 0 ng/mL，次烏頭堿為1.048～104.800 ng/mL，新烏頭堿為1.268～126.800 ng/mL。

精密度試驗(yàn)：取混合對(duì)照品溶液適量，按擬訂試驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿峰面積的RSD分別為0.6%，1.1%和0.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一（批號(hào)為201703101）批樣品，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿峰面積的RSD分別為1.2%，0.9%，1.2%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為201703101）樣品，依法制備供試品溶液，共6份，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算含量。結(jié)果烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量 分 別 為1.58，25.58，11.85μg/mL，RSD分 別 為3.8%，3.9%，1.8%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批（批號(hào)為201703101）樣品10瓶，混勻，精密量取6份樣品，各2.5 mL，再分別精密加入烏頭堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為367.9μg/mL）0.015 mL，次烏頭堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為419.2μg/mL）0.160 mL，新烏頭堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為507.3μg/mL）0.065 mL，用0.1 mol/mL的鹽酸調(diào)pH至3，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量及回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 對(duì)照品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.1 MRM chromatograms of reference solution

圖2 供試品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.2 MRM chromatograms of the three kinds of aconitine alkaloids in test solution

圖3 陰性對(duì)照品溶液MRM色譜圖A.Aconitine B.Hypaconitine C.MesaconitineFig.3 MRM chromatograms of negative test solution

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密量取各批次樣品5 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂試驗(yàn)條件進(jìn)樣測(cè)定，以外標(biāo)法定量離子峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 測(cè)定方法選擇

預(yù)試驗(yàn)中曾嘗試用普通高效液相色譜法測(cè)定，但由于走川骨刺酊是以滲漉法提取制成，不同產(chǎn)地、不同采收時(shí)間和不同的炮制方法導(dǎo)致所用草烏藥材的烏頭類生物堿含量也不一樣，并且樣品中含有的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿量也較少，達(dá)不到高效液相色譜法的檢出要求。具有高分離能力，高選擇性、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的LC-MS/MS技術(shù)，能滿足測(cè)定走川骨刺酊中3種烏頭堿含量的條件。

3.2 樣品提取方法選擇

預(yù)試驗(yàn)中嘗試樣品取樣量為10 mL，氮吹干后直接用流動(dòng)相定容至50 mL，濾過(guò)，進(jìn)樣，但因出現(xiàn)平頭峰無(wú)法測(cè)定；取樣量為5 mL，氮吹干后直接用流動(dòng)相定容至50 mL，再稀釋50倍后，濾過(guò)，進(jìn)樣，平頭峰消失；還嘗試過(guò)40℃旋蒸蒸干、水浴鍋蒸蒸干、用0.1 mol/mL鹽酸調(diào)pH等3種方法提取，結(jié)果顯示，直接調(diào)pH提取效果較好。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests（n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（μg/mL）Tab.3 Results of content determination of samples（μg/mL）

3.3 固相萃取柱選擇

樣品成分較復(fù)雜，需凈化。在廠家提供的樣品中3種烏頭堿含量均較低，需對(duì)烏頭類生物堿進(jìn)行痕量濃縮，而烏頭類生物堿屬有機(jī)堿類，MCX固相萃取柱是凈化和富集堿性化合物的強(qiáng)有力工具，特別是有機(jī)堿類，本試驗(yàn)中選擇了MCX固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，結(jié)果達(dá)到了試驗(yàn)要求。固相萃取柱在中成藥檢驗(yàn)中的應(yīng)用有待進(jìn)一步摸索。

3.4 小結(jié)

該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于同時(shí)測(cè)定走川骨刺酊中3種烏頭類生物堿的含量測(cè)定。不同批次樣品中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量存在一定差異，可能與使用的草烏藥材的部位、采收時(shí)間及炮制方法的不同有關(guān)。