俞曉鳳,曾曉健,封昀,劉霞霞,陳曉恬,劉潔,尹明華

(上饒師范學院 生命科學學院,江西 上饒 334001)

植物種質(zhì)資源是生物多樣性的基礎,也關系到一個國家的經(jīng)濟命脈。到目前為止,地球上的植物種類約有55 萬種,僅有1 500多種被人類利用[1]。隨著生物技術在人類生活中的廣泛應用,人類對植物種質(zhì)資源的依賴程度越來越高,但植物種質(zhì)資源在人類的開發(fā)和利用中逐漸變得狹窄,甚至有些物種的野生資源已經(jīng)瀕臨滅絕[2]。再加上隨著人口膨脹、土地開發(fā)、環(huán)境惡化和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,品種單一化在世界范圍內(nèi)愈演愈烈[3]。因此,對植物種質(zhì)資源進行保存具有重大的現(xiàn)實意義。

植物種質(zhì)資源一般采用原地保存(In situ conservation)和異地保存(Ex situ conservation)兩種方式[3]。原地保存容易受到自然災害和病蟲害的侵襲造成種質(zhì)丟失,而常規(guī)的異地保存如建立種質(zhì)圃、種子庫和植物園等方式也存在栽培環(huán)境不適和管理粗放等問題,易引起種性退化[4]。況且原地保存和常規(guī)異地保存均需要耗費大量的物力、人力和財力[5]。鑒于此,通過植物組織培養(yǎng)技術實現(xiàn)種質(zhì)資源的另一類異地保存方式即離體保存(In vitro conservation)技術應勢而生。植物種質(zhì)資源離體保存技術是利用植物生物技術手段對植物材料進行無菌培養(yǎng),在培養(yǎng)過程中添加各類生長抑制條件,延緩或停止其生長,減少其繼代培養(yǎng)時間,以達到植物種質(zhì)資源中長期保存的目的[6]。離體保存技術一般有兩種,一種是緩慢生長離體保存,另一種是超低溫離體保存[7]。這兩種離體保存方式可以打破植物生長季節(jié)限制,具有貯存空間小、勞動力和維持開支少、便于種質(zhì)運輸和國際交流等優(yōu)點,可防止田間地頭多代繁殖造成種性退化及病毒感染,保證了種質(zhì)的優(yōu)良性和遺傳穩(wěn)定性,得到了世界各國的重視[8－9]。但緩慢生長離體保存是在常規(guī)培養(yǎng)條件下對培養(yǎng)材料限制生長保存的方法,保存時間較短,還需要定期繼代,易造成人為失誤混淆和污染,甚至會引起遺傳變異[10]。超低溫保存(cryopreservation)是指在－80 ℃以下的溫度(一般用液氮為冷源,－196 ℃)下對植物種質(zhì)資源進行保存的技術[11]。在此極低的溫度下,植物材料代謝和衰老基本中止[11],無須繼代,無變異發(fā)生,可以減少工作量,減少污染機會,是目前植物種質(zhì)資源保存最理想最安全穩(wěn)定的方式[12－13]。超低溫保存一般有4種方法,即玻璃化法超低溫保存、小滴玻璃化法超低溫保存、包埋玻璃化法超低溫保存和包埋脫水法超低溫保存。本文對這4種方法進行概述,旨在闡明植物種質(zhì)資源超低溫保存的研究現(xiàn)狀,為植物種質(zhì)資源超低溫保存的后續(xù)研究提供一個大致的方向。

1 玻璃化法超低溫保存

玻璃化法超低溫保存(cryopreservation by vitrification)是植物材料經(jīng)高濃度玻璃化保護劑處理后進行液氮保存的方法[14]。其基本程序是:預培養(yǎng)、體積分數(shù)60% PVS2(plant vitrification solution,MS ＋質(zhì)量濃度300 g/L 甘油＋質(zhì)量濃度150 g/L聚乙二醇＋質(zhì)量濃度150 g/L二甲基亞砜＋摩爾濃度0.4 mol/L 蔗糖,p H＝5.8)裝載體積分數(shù)100%PVS2脫水、液氮保存、化凍、洗滌、凍后培養(yǎng)等環(huán)節(jié)[15]。Sakai等[16]采用玻璃化冷凍法成功地保存了臍橙(Citrus sinensis Osb.var.brasiliensis Tanaka)的珠心細胞,通過體積分數(shù)60%PVS2在25 ℃條件下裝載5 min以及體積分數(shù)100%PVS2在0 ℃條件下脫水3 min,平均成活率約80%,且整個程序完成僅需10 min 左右。Niino 等[17]通過玻璃化冷凍成功保存蘋果(Malus domestica Borkh.cv.Fuji)離體培養(yǎng)的莖尖,通過5℃下MS＋摩爾濃度0.7 mol/L蔗糖培養(yǎng)基中預培養(yǎng)1 d以及25 ℃下PVS2液脫水80 min,平均成活率約為80%,且該方法成功應用于5個蘋果品種和8個梨品種,是一種很有前途的果樹試管苗莖尖超低溫保存技術。Towill和Jarret[18]認為玻璃化冷凍是一種技術上簡單的植物種質(zhì)超低溫保存方法,只需使用合適的超低溫保護劑和快速降溫,甘薯莖尖在玻璃化誘導預處理后,在液氮(－196 ℃)下存活;在生長培養(yǎng)基中,用含有質(zhì)量濃度300 g/L 甘油、質(zhì)量濃度150 g/L 乙二醇和質(zhì)量濃度150 g/L二甲基亞砜的玻璃化溶液逐步地處理莖尖;莖尖在低濃度玻璃化液中孵育1～2h,可提高成活率;大多數(shù)存活的莖尖發(fā)育出愈傷組織,隨后形成的芽的百分比是可變的,但采用兩步冷卻法不能獲得生存。Sakai等[19]采用玻璃化法成功地保存了離體培養(yǎng)的芥末頂端分生組織,通過摩爾濃度2 mol/L 甘油和摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖25 ℃裝載20 min以及25 ℃PVS2脫水10 min,凍后正常芽的形成率約為80%～90%,且該方法已成功應用于其他三個芥末品種。Matsumoto等[20]采用玻璃化法成功地保存了日本粉百合鱗莖段培養(yǎng)誘導的不定芽頂端分生組織,切除的頂尖分生組織在含有摩爾濃度0.3 mol/L 蔗糖的固體MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng),在25 ℃下放置1 d,然后在25 ℃下轉(zhuǎn)入摩爾濃度2 mol/L甘油加摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖的裝載液中裝載20 min。然后在25 ℃下用PVS2充分脫水20 min,或在0 ℃下放置110 min,然后浸入液氮中。在40℃水浴中快速升溫后,將分生組織放入1.8 m L摩爾濃度1.2 mol/L蔗糖中20 min,然后放置在固體MS培養(yǎng)基上的濾紙上。復蘇的分生組織在5 d內(nèi)恢復生長,直接產(chǎn)生新梢。4周后芽形成率約為80%。不定芽鱗片段在0 ℃低溫處理7 d以上,成苗率顯著提高。該方法已成功應用于其他5個百合品種。因此,玻璃化法超低溫保存作為百合分生組織冷凍保存的常規(guī)方法具有廣闊的應用前景。Channuntapipat等[21]采用一步玻璃化法成功地對兩個杏接穗品種‘Ne Plus Ultra’和‘Nonpareil 15－1’以及一個杏桃雜交砧木的莖尖進行了超低溫保存,‘Ne Plus Ultra’‘Nonpareil 15－1’以及杏桃雜交砧木的成活率分別為87.5%、60.0%和72.5%。Liu等[22]采用新的玻璃化溶液PVSL 對離體生長的蘋果Gala莖尖進行了玻璃化冷凍保存,平均成活率和成芽率分別高達81%和77%;存活芽的再生模式和速度與未處理對照相同,并發(fā)育正常的芽和根;對照組與超低溫保存組在芽長、葉形、葉寬長比、根長等形態(tài)特征上無顯著差異(P＜0.05);凍后再生苗葉片不定芽的再生速度和頻率與未凍對照相同;對照組與超低溫保存組可溶性蛋白和POD 同工酶電泳譜帶無明顯差異;15對隨機引物和6對AFLP引物在對照和凍后再生苗中均未檢測到不同的RAPD 和AFLP片段;玻璃化法超低溫保存是蘋果種質(zhì)資源長期保存的一種實用方法。Liu等[23]采用玻璃化法成功超低溫保存了離體蘋果莖尖,平均成活率和成芽率分別為80%和76%;凍后存活芽的生長速度和再生模式與未處理的對照相同;對照組與超低溫保存組在芽長、葉形、葉寬長比、根長等形態(tài)特征上無顯著差異(P＜0.05);用12對微衛(wèi)星和11對ISSR 引物檢測到對照和超低溫保存的芽之間沒有不同的微衛(wèi)星等位基因和ISSR 片段;玻璃化法超低溫保存是蘋果種質(zhì)資源長期保存的一種實用方法。朱東姿等[24]為有效保存甜櫻桃矮化砧木吉塞拉的種質(zhì)資源,對其玻璃化法超低溫保存進行正交試驗,建立和優(yōu)化了其玻璃化法超低溫保存技術體系,切取4 ℃低溫鍛煉組培苗莖尖,置于摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖中預培養(yǎng)1 d,0 ℃下PVS3脫水60 min,莖尖的存活率最高且遺傳穩(wěn)定性好。吳怡等[15]以莪術組培苗莖尖為試材,建立了莪術莖尖玻璃化法超低溫保存技術體系,2～3 mm 莖尖于MS＋摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖的固體培養(yǎng)基上預培養(yǎng)7 d后,用體積分數(shù)60%PVS2室溫下裝載10 min以及0 ℃下體積分數(shù)100%PVS2脫水30 min,莪術莖尖的生活力高達100%。Antony等[25]對玻璃化法超低溫保存后的Dendrobium Sabin Blue類原球莖進行了生化分析,結果表明,凍后Dendrobium Sabin Blue類原球莖葉綠素、胡蘿卜素和卟啉含量顯著下降,而且過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶的活性在玻璃化法超低溫保存不同階段出現(xiàn)了顯著波動。

2 小滴玻璃化法超低溫保存

小滴玻璃化法超低溫保存(cryopreservation by droplet－vitrification)與玻璃化法較為相似,主要的區(qū)別是將高濃度玻璃化保護劑滴到鋁箔條,再將鋁箔條轉(zhuǎn)移到冷凍管進行液氮保存。其基本程序是:預培養(yǎng)、裝載液(MS＋摩爾濃度2 mol/L甘油＋摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖)裝載、玻璃化保護劑脫水、小滴玻璃化處理(將PVS2脫水處理過的植物材料放到無菌鋁箔條內(nèi)含PVS2液滴上)、液氮保存、化凍、洗滌、凍后培養(yǎng)等環(huán)節(jié)[11,26]。Yoon等[27]采用小滴玻璃化法研究了兩個馬鈴薯品種(Dejima和STN13)超低溫保存后母株繼代培養(yǎng)和莖尖預培養(yǎng)的效果;繼代培養(yǎng)條件(光照強度、通氣量和種植密度)對兩個品種的非超低溫保存和超低溫保存莖尖的存活都有顯著影響;離體培養(yǎng)時間和莖尖位置對離體莖尖存活有顯著影響(P＜0.000 1);Dejima和STN13的最適繼代時間分別為7周和5周,最適莖尖大小分別為1.5～2.0 mm 和1.0～1.5 mm;凍存莖尖的存活率受預培養(yǎng)基中蔗糖濃度和預培養(yǎng)時間的影響;用摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖預培養(yǎng)8 h,然后用摩爾濃度0.7 mol/L蔗糖預培養(yǎng)18 h,觀察到低溫保存莖尖的最高存活率,這些結果表明,母株繼代培養(yǎng)和莖尖預培養(yǎng)的參數(shù)應謹慎優(yōu)化。Kim 等[28]認為對于基因庫來說,低溫保存程序在廣泛的基因型中的適用性是一個關鍵問題,從栽培和野生馬鈴薯品種中找出導致超低溫保存莖尖存活差異的關鍵因素具有重要的現(xiàn)實意義;小滴玻璃化法是小滴冷凍和溶液玻璃化冷凍相結合的方法;PVS2脫水20 min后,將莖尖置于PVS2溶液滴在鋁箔條上冷卻,將箔條插入摩爾濃度0.8 mol/L蔗糖溶液(40 ℃下)中加熱30 s,然后在摩爾濃度0.8 mol/L蔗糖中卸載30 min,冷凍后存活率高,該優(yōu)化方案成功地應用于12份材料,存活率在64.0%～94.4%之間。Gallard等[29]通過優(yōu)化加載液(LS)和植物玻璃化液2(PVS2)的時間,采用小滴玻璃化法對天竺葵莖尖進行超低溫保存;將切除的莖尖分兩步脫水(LS為20 min,PVS2為15 min),然后直接浸入液氮中;在室溫下,在復蘇液中解凍和卸載15 min后,在半固態(tài)的MS培養(yǎng)基上接入莖尖;這一簡單的無須任何預處理的方法成功地應用于8個品種,成活率在55.6%～96.2%之間,再生率在9.1%～70.6%之間,這些結果證明了天竺葵種質(zhì)資源超低溫保存長期保存的可行性。Pinker等[30]采用小滴玻璃化法對草莓(Fragaria x ananassa DUCH.cvs.‘Senga Sengana’,‘Korona’and‘Aroma’)的莖尖進行了超低溫保存;2～3 mm 長的莖尖在蔗糖(0.1,0.25,0.5,0.75,1.0 mol/L)培養(yǎng)基中預培養(yǎng)24 h和48 h,然后移入6滴PVS2玻璃化液中20 min,并浸入液氮中;在液體介質(zhì)中室溫快速復溫;在所有品種中,用摩爾濃度0.25 mol/L蔗糖預培養(yǎng)24 h后恢復率最高(60%);在凍后恢復的莖尖中,并非所有的莖尖都繼續(xù)發(fā)育和繁殖;田間觀察到的脫落類型受蔗糖濃度的影響;在摩爾濃度0.1 mol/L蔗糖中預培養(yǎng)后,未觀察到脫落類型,而在高蔗糖濃度中預培養(yǎng)后,脫落類型的數(shù)量在最高蔗糖濃度下高達20%。白建明等[31]對馬鈴薯莖尖小滴玻璃化法超低溫保存進行了研究,結果表明,馬鈴薯莖尖在MS＋摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖和MS＋摩爾濃度0.5 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中分別預培養(yǎng)1 d后,0℃下PVS2脫水30 min,然后轉(zhuǎn)到鋁箔條上約15μL的PVS2小滴中,最后投入液氮保存,存活率和再生率最高達79.91%和62.52%;通過SSR 分子標記檢測,再生植株無遺傳變異。Kim和Lee[32]認為盡管合適的超低溫保存方案是基礎研究和大規(guī)模實施以及進一步超低溫保存研究的先決條件,但這一過程依賴于反復試驗;在玻璃化法超低溫保存技術中,小滴玻璃化法超低溫保存具有較高的冷凍后回收率。然而,該程序本身不能解決植物超低溫保存的問題,突出的問題是由于細胞毒性玻璃化溶液造成的脫水;建議用摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖進行31 h的漸進式預培養(yǎng),用摩爾濃度0.7 mol/L 蔗糖進行17 h的漸進式預培養(yǎng),用玻璃化溶液C4－35%(質(zhì)量濃度175 g/L甘油＋質(zhì)量濃度175 g/L 蔗糖)加載20至40 min,在室溫下用A3—90%(質(zhì)量濃度375 g/L甘油＋質(zhì)量濃度150 g/L二甲基亞砜＋質(zhì)量濃度150 g/L乙二醇＋質(zhì)量濃度225 g/L蔗糖)的玻璃化溶液脫水10—30 min或B1－體積分數(shù)100%(PVS3)脫水40～120 min,用鋁箔條冷卻樣品,浸入預熱(40 ℃)的卸載溶液(摩爾濃度0.8 mol/L 蔗糖)中再加熱,然后根據(jù)材料的尺寸和滲透性,進一步卸載20 min至60 min;使用這種系統(tǒng)的方法,可識別材料是否耐受或敏感的化學毒性和滲透脅迫與玻璃化溶液脫水,從而揭示了在溶液為基礎的玻璃化方法的主要障礙;根據(jù)樣品的敏感性,可設計一個小滴玻璃化過程,即預培養(yǎng)、裝載、玻璃化溶液脫水、冷凍和復溫;利用這種方法,有助于制定合適的小滴玻璃化冷凍方案。Yin等[33]報道了一種簡便易行、應用廣泛的百合莖尖超低溫保存方法;該方法以在芽再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周葉段誘導的不定芽為試材;切取1.5～2 mm 長包括2～3葉原基的莖尖先在MS培養(yǎng)基上用摩爾濃度0.5 mol/L蔗糖預培養(yǎng)1 d,然后用含摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖和摩爾濃度2 mol/L甘油的裝載液裝載20 min,然后在0 ℃下用PVS2脫水4 h;脫水的莖尖轉(zhuǎn)移到鋁箔條上的2.5μL PVS2液滴上;在含有摩爾濃度1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中,在室溫下將冷凍的莖尖復溫20 min,然后進行解凍后培養(yǎng)可獲得莖尖再生;使用簡單序列重復標記進行的評估發(fā)現(xiàn),這種百合液滴玻璃化冷凍保存方法高效、簡便,可廣泛適用于百合遺傳資源的長期保存。李倫政等[11]認為在胚狀體再生過程中的胚性細胞一般采用繼代培養(yǎng)進行保存,容易造成遺傳變異或種性退化,而小滴玻璃化法超低溫保存能有效保持胚性細胞的遺傳穩(wěn)定性;4 ℃條件下,在摩爾濃度0.3、0.5、0.7 mol/L蔗糖培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3 d的海島棉XH33胚性細胞,再經(jīng)過PVS2裝載20 min和脫水20 min,細胞存活率高達55.55%;流式細胞術和SSR 分子標記結果表明,小滴玻璃化法超低溫保存并未影響海島棉XH33胚性細胞的遺傳穩(wěn)定性。

3 包埋玻璃化法超低溫保存

包埋玻璃化法超低溫保存(cryopreservation by encapsulation－vitrification)是將包埋法和玻璃化法結合起來進行液氮保存的方法。其基本程序是:預培養(yǎng)、包埋、裝載(海藻酸鈉和氯化鈣凝膠系統(tǒng))、PVS2脫水、液氮保存、化凍、洗滌、凍后培養(yǎng)等環(huán)節(jié)[34]。Matsumoto等[35]采用包埋玻璃化法對離體培養(yǎng)的芥末頂端分生組織進行了超低溫保存,成活率達95%以上。Hirai等[36]以離體草莓(Fragaria×ananassa Duch.)為材料,采用玻璃化溶液對海藻酸鈉包被的分生組織進行了超低溫保存;在黑暗中,從4 ℃下低溫鍛煉的植株上切下的分生組織在兩周內(nèi)被包裹在含有摩爾濃度2 mol/L甘油和摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖混合物的海藻酸鈉凝膠珠中;這些被包裹和冷凍保護的分生組織在浸入液氮之前,用PVS2在0℃下脫水2 h;分生組織包埋玻璃化成功后,在未形成中間愈傷組織的情況下,在1周內(nèi),分生組織保持綠色,并發(fā)育出新梢;包埋玻璃化分生組織的平均成苗率接近90%;該方法在4個草莓品種上成功應用;還證實了冷卻至－196℃的包埋玻璃化法分生組織比包埋脫水法分生組織更有利于芽的形成和分生組織的復蘇;Hirai和Sakai[37]用包埋玻璃化法成功超低溫保存了馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)腋芽離體培養(yǎng)的分生組織,用摩爾濃度2 mol/L 甘油＋摩爾濃度0.6 mol/L蔗糖的混合物處理分生組織90 min;再用PVS 20 ℃下脫水3 h;凍后無愈傷組織形成;平均成苗率近70%;用17個引物對超低溫保存和未處理的植株進行RAPD 分析,兩者無遺傳差異。該方法還證實了包埋玻璃化法超低溫保存比包埋脫水法超低溫保存有利于分生組織的芽形成。Tanaka等[38]采用玻璃化法和包埋玻璃化法成功地對不同龍膽品種(系)離體植株的莖尖進行了超低溫保存;盡管這兩種方案在液氮中儲存后的存活率都很高,但與玻璃化方案相比,包埋玻璃化法方案有幾個明顯的優(yōu)勢:(i)在最佳條件下存活率更高;(ii)PVS2的最佳暴露時間范圍更廣;(iii)包埋玻璃化法超低溫保存的莖尖再生明顯更為旺盛和迅速。用這兩種方法對10個龍膽屬植物品種的莖尖進行了玻璃化法超低溫和包埋玻璃化法超低溫,平均存活率分別為49.0%和73.7%。這些結果表明,該研究所優(yōu)化的兩種方案對龍膽遺傳資源的超低溫保存具有廣闊的應用前景。Gámez－Pastrana等[39]對菠蘿莖尖的包埋玻璃化法超低溫保存處理方法進行了一些改進;裝載前莖尖在蔗糖－脯氨酸中的預生長顯著縮短了成功超低溫保存所需的PVS2 和PVS3的暴露時間;在0 ℃下用PVS3包埋和處理,在冷卻前后存活率最高;最適條件是將菠蘿根尖包埋在海藻酸鈣(質(zhì)量濃度30 g/L)中,然后用摩爾濃度0.16 mol/L蔗糖＋摩爾濃度0.3 mol/L脯氨酸和摩爾濃度0.3 mol/L蔗糖＋摩爾濃度0.3 mol/L 脯氨酸預培養(yǎng)分別進行預培養(yǎng)2 d 和24 h,室溫下用摩爾濃度0.75 mol/L蔗糖＋摩爾濃度1 mol/L甘油裝載液處理25 min,0℃下用PVS3脫水60 min,MD－2和Puerto Rico兩品種的莖尖存活率分別為54%和83%。Wang等[40]采用包埋玻璃化法成功地保存了兩個葡萄砧木:110 Ritcher(V.berlandieri×V.ruperstris)、41B(V.vinifera×V.berlandieri)和幾個釀酒葡萄品種(Vitis vinifera)的懸浮胚性細胞,在蔗糖摩爾濃度為0.75 mol/L的情況下預培養(yǎng),并在0 ℃下PVS2脫水270 min時,懸浮胚性細胞的存活率為42%～76%;生化分析表明,蔗糖預培養(yǎng)導致懸浮胚性細胞總可溶性蛋白和糖水平的變化;盡管凍后細胞的鮮重增加明顯低于對照細胞,但在胚性細胞懸浮體系重新建立后,兩次傳代后冷后細胞和對照細胞的生長模式相同,是一套適用于不同葡萄品種的通用高效低溫保存系統(tǒng)。婁漢平等[41]對樹莓莖尖包埋玻璃化法超低溫保存進行了研究,建立了簡單、高效的樹莓種質(zhì)資源包埋玻璃化法超低溫保存程序,成活率達85%。陳紅和韓曉瑩[42]以貴州特有的地方李資源——酥李為材料,建立和優(yōu)化了其包埋玻璃化法超低溫保存技術體系,莖尖存活率達21%。張玲等[43]研究了蔗糖、預培養(yǎng)及玻璃化保護液對胡楊休眠莖尖包埋玻璃化法超低溫保存的影響;含有休眠莖尖的褐藻酸鈣膠球在摩爾濃度0.8 mol/L蔗糖溶液中預培養(yǎng)24 h,經(jīng)質(zhì)量濃度400 g/L甘油＋質(zhì)量濃度450 g/L 蔗糖＋質(zhì)量濃度100 g/L 聚乙二醇(400 0)＋質(zhì)量濃度50 g/L二甲基亞砜的玻璃化保護液室溫下脫水30 min后,可以獲得較好的存活率。許丹爾等[44]將包埋玻璃化法應用于苔蘚植物的超低溫保存也取得了成功;卵葉泥炭蘚無菌苗4 ℃下預培養(yǎng)3 d,0 ℃下用體積分數(shù)60%PVS2裝載30 min,PVS2脫水60 min,成活率可達42.4%,未發(fā)生遺傳變異。

4 包埋脫水法超低溫保存

包埋脫水法超低溫保存(cryopreservation by encapsulation－dehydration)又稱為包埋干燥法超低溫保存,來源于人工種子的想法,不采用高濃度玻璃化保護劑脫水而是采用無菌風或硅膠脫水后進行液氮保存。其基本程序包括預培養(yǎng)、包埋(海藻酸鈉和氯化鈣凝膠系統(tǒng))、熱吹風脫水或硅膠脫水、液氮保存、化凍、凍后培養(yǎng)等環(huán)節(jié)[45]。Paulet等[46]建立了甘蔗離體試管苗莖尖的包埋脫水法超低溫保存方法;莖尖分離后,在標準培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d,然后用質(zhì)量濃度30 g/L海藻酸鈉包埋;最佳條件為:在摩爾濃度0.73 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中預培養(yǎng)2 d,在層流下干燥6 h,或在硅膠中干燥10～11 h,然后快速冷凍和緩慢解凍;5個供試品種在液氮中冷凍后的存活率在38%～91%之間;包埋脫水法超低溫保存并沒有改變植物的氨基亮氨酸肽酶和淀粉酶的電泳圖譜。Bachiri等[47]采用海藻酸鈉微珠包埋技術對長春花細胞懸液進行超低溫保存;微囊化細胞在蔗糖強化培養(yǎng)基中預培養(yǎng)數(shù)天,硅膠干燥,液氮直接冷卻;室溫空氣復溫后,將海藻酸鈉微珠置于半固態(tài)培養(yǎng)基上;再生后轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中的珠子產(chǎn)生了一種新的細胞懸浮液;凍存微囊細胞的存活和再生取決于預培養(yǎng)時間和空氣干燥后的殘余水分含量。Sakai等[48]提出了一種簡單有效的植物超低溫保存的包埋脫水方案,該方案是玻璃化與包埋脫水的折中方案,與傳統(tǒng)的包埋脫水法相比,該方法縮短了超低溫保存程序所需的時間,并在三種被測植物(芥末、菊花和薄荷)中產(chǎn)生了更高的恢復生長率。Gonzalez－Arnao和Engelmann[49]認為包埋脫水是在人工種子生產(chǎn)技術的基礎上發(fā)展起來的一種超低溫保存技術,即外植體包埋在海藻酸鈣珠中;包裹的外植體在高蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中進行預培養(yǎng),并在冷凍前部分干燥;對外植體進行包埋可以使后續(xù)的處理非常劇烈,包括高糖濃度的預培養(yǎng)和低含水量的干燥,這將對未包埋的樣品造成嚴重損害或致命,以甘蔗莖尖為例,一種包括預處理、包封、預培養(yǎng)、干燥、冷凍和貯存、解凍和再生等步驟的包埋脫水方案已進行優(yōu)化并成功應用于約40種不同植物。Wood等[50]用海藻酸鈉珠包埋蘭花種子。在摩爾濃度0.75 mol/L的最佳濃度下用蔗糖預處理18 h,降低了無菌空氣流[23 ℃,相對濕度30%RH(Relative Humidity)]中的干燥速率,并在長達16 h的干燥后提高了種子的存活率;將預處理和16 h干燥的珠子轉(zhuǎn)移到冷凍小瓶中,隨后在低溫范圍內(nèi)保存30 d;當珠子預干燥至約20%的水分含量時,在－196 ℃下保存1 d不會對蘭花的胚胎生長產(chǎn)生不利影響,并提出超低溫有可能作為不同分類群的保存工具。Wang等[51]采用包埋脫水法成功地將葡萄胚性細胞懸浮液超低溫保存并實現(xiàn)了植株再生。當包埋的細胞脫水至20.6%的含水量并在摩爾濃度1 mol/L蔗糖上進行2～4 d的預培養(yǎng)時,超低溫保存的細胞獲得了最佳的存活率,并發(fā)現(xiàn)含質(zhì)量濃度2.5 g/L AC的MGN 固體培養(yǎng)基能提高凍后細胞的活力;盡管冷凍保存的細胞在再生過程中表現(xiàn)出5d的滯后期,其鮮重的增加僅為對照細胞的一半,但在細胞懸浮液中重新建立后,其生長模式與兩次傳代后的對照細胞相同;與對照和脫水處理相比,超低溫保存促進了胚胎發(fā)生和隨后的植物萌發(fā);從低溫保存的細胞中再生的植株葉片形態(tài)與從對照細胞中再生的植株相似。González－Arnao等[52]采用包埋脫水技術對柑橘不同基因型的胚珠和體細胞胚進行了超低溫保存。在含摩爾濃度0.75 mol/L、摩爾濃度1 mol/L或摩爾濃度1.25 mol/L蔗糖的液體培養(yǎng)基中,不同的預培養(yǎng)條件下,低溫保存胚珠的存活率是不穩(wěn)定的;建立了兩種胚性來源(胚珠和柱頭、花柱和子房的薄層外植體)體細胞胚的高效低溫保存方法,可獲得較高的存活率(75%～100%);組織學研究表明,經(jīng)過包埋脫水處理的胚胎,體內(nèi)積累了大量的蔗糖,保證了超低溫保存后整個胚胎的恢復。Clavero－Ramírez等[53]介紹了幾種草莓基因型莖尖包埋脫水法超低溫保存方法的研究結果,莖尖包裹在海藻酸鈉凝膠中,在含有高濃度蔗糖(摩爾濃度0.8 mol/L,常規(guī)方案)或摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖和摩爾濃度2 mol/L甘油組合的培養(yǎng)基上預培養(yǎng),不同基因型的成活率不同(23%～63%);摩爾濃度0.4 mol/L蔗糖和摩爾濃度2 mol/L甘油組合預培養(yǎng)大大縮短了超低溫程序所需的時間。

5 展望

超低溫保存技術是植物離體保存技術中最為重要的技術之一,與傳統(tǒng)的生境保存和非生境保存相比,可節(jié)約大量的物力、財力和人力,還可避免遭受外界環(huán)境的破壞,具有很強的實際應用性[54]。目前,常用的超低溫保存方法主要包括玻璃化法、包埋脫水法、包埋玻璃化法和小滴玻璃化法等方法。玻璃化法超低溫保存,由于保護劑濃度高,對材料毒害作用較大,對脫水過程和保護劑滲透性需嚴格控制,且同一時間處理材料有限;包埋脫水法超低溫保存一般利用海藻酸鈣將材料包埋后放置高濃度蔗糖培養(yǎng)基中預培養(yǎng),利用無菌空氣流脫水,投入液氮中貯存的包埋脫水法,彌補了玻璃化法的不足,但相對玻璃化法脫水時間長、組織恢復生長慢、部分植物材料成苗率低;包埋玻璃化法超低溫保存是在包埋脫水法和玻璃化法的基礎上發(fā)展出來的,將材料放入氯化鈣和海藻酸鈉組成的包埋液形成小球后置于玻璃化溶液中脫水,然后投入液氮保存,該方法存活率高,脫水時間短,材料恢復生長較快,方法簡便易操作;小滴玻璃化法超低溫保存是一種相對較新的方法,即材料經(jīng)預培養(yǎng)后用裝載液和玻璃化液對材料進行處理,隨后將材料轉(zhuǎn)入滴有PVS2 鋁箔條上形成小滴,再將鋁箔條放入裝有液氮的冷凍管中,然后液氮保存,該方法具有存活率、再生率高、適用性廣、處理量大、操作簡單等特點。在進行植物種質(zhì)資源超低溫保存時,可根據(jù)自己的實驗室條件和實際需求,對上述4種超低溫保存方法進行合適的選擇,以達到植物種質(zhì)資源長期保存的預期效果。