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        高尿酸血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性及其誘發(fā)機(jī)制研究

        2021-01-29 06:08:00刁力李波
        關(guān)鍵詞:偶聯(lián)高尿酸尿酸

        刁力 李波

        海陽市人民醫(yī)院 265100

        高尿酸血癥是體內(nèi)嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄異常所致的血尿酸水平升高,已經(jīng)成為一種常見病,不僅可以導(dǎo)致痛風(fēng)、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及痛風(fēng)性腎病,其對(duì)心血管系統(tǒng)也有損傷作用,是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。近年來一些研究顯示高尿酸可刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能異常[2-4],但具體機(jī)制尚不清楚。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的病理基礎(chǔ),在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程中扮演著重要作用[5],對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能受損機(jī)制的研究已成為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的研究熱點(diǎn)。本研究體外培養(yǎng)HUVEC,觀察不同濃度的尿酸對(duì)HUVEC的ROS水平、NO含量及eNOS mRNA表達(dá)的影響,了解尿酸對(duì)內(nèi)皮損傷的作用途徑,以探討高尿酸血癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治有應(yīng)用價(jià)值。

        1 材料與方法

        1.1 材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(中心實(shí)驗(yàn)室友情提供);DMEM、0.25%胰酶/0.02%EDTA、胎牛血清(Hyclone 公司);尿酸(Sigma 公司);青霉素-鏈霉素雙抗(Solarbio 公司);磷酸鹽緩沖液(Solarbio 公司);eNOS 抑制劑L-NAME(Selleckchem 公司);無水乙醇、異丙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);PCR 引物(生工生物工程上海股份有限公司);ROS 熒光探針-DHE(威格拉斯生物技術(shù)有限公司);NO 試劑盒(南京建成生物工程研究所);總RNA 試劑盒(美國Omega 公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒(天根生物公司)。

        1.2 方法

        1.2.1 尿酸溶液的配置 1 ml NaOH 液體(1 mmol/L)中加入13.45 mg尿酸粉末,溶解后加至49 ml DMEM 完全培養(yǎng)基中,混勻過濾除菌至50 ml無菌離心管中,吸取300 μl測定其尿酸濃度,由所測結(jié)果調(diào)整至目標(biāo)濃度1 600 μmol/L。以DMEM完全培養(yǎng)基稀釋尿酸原液至200、400、600、800 μmol/L。

        1.2.2 HUVEC 的培養(yǎng)及試驗(yàn)分組 (1)將凍存的HUVEC復(fù)蘇、培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)為10×104于12孔板中,設(shè)置為5組:對(duì)照組(單純培養(yǎng)基組)、試驗(yàn)組4組(分別為200、400、600、800 μmol/L 尿酸刺激組),各組分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h,觀察尿酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。(2)選擇結(jié)果較穩(wěn)定的600 μmol/L尿酸刺激組,設(shè)置為3組:對(duì)照組(單純培養(yǎng)基組)、試驗(yàn)組(600 μmol/L 尿酸刺激組)、L-NAME干預(yù)組(100 μmol/L L-NAME預(yù)處理15 min,再與600 μmol/L尿酸溶液共同孵育48 h),觀察高尿酸對(duì)eNOS 脫偶聯(lián)的影響。以上每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3板。

        1.2.3 DHE 熒光染色法測定 ROS 水平 5 mmol/L 的DHE溶液加入12孔板中,熒光探針終濃度為5 μmol/L,恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min,PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察到有HUVEC 細(xì)胞的視野,以綠光激發(fā),陰性對(duì)照孔下調(diào)整背景熒光強(qiáng)度,觀測并記錄不同濃度尿酸刺激后HUVEC 內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

        1.2.4 上清液NO含量檢測 根據(jù)NO試劑盒說明書操作,測定細(xì)胞上清液NO 含量。每組3復(fù)孔。

        1.2.5 熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達(dá) 提取細(xì)胞總RNA,測其純度與濃度。按天根公司KR106 FastQuant RT Ki 試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以eNOS為引物、β-action 為內(nèi)參,按天根公司 FP205 SYBR Green 試劑盒說明書,Bio-Rad 儀進(jìn)行熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達(dá)。反應(yīng)條件:95oC、15 min,95oC、10 sec,60oC、32 sec,循環(huán)40 次。△△Ct=(目的基因Ct 值-內(nèi)參 Ct值)試驗(yàn)組-(目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值)對(duì)照組。試驗(yàn)組目的基因?qū)τ趯?duì)照組目的基因的表達(dá)量即為2-△△Ct。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件,數(shù)值以(±s)表示。多組間兩兩比較符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析(one-way ANOVA)Tukey 法,不符合正態(tài)分布的采用Dunnett法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 尿酸對(duì)HUVEC ROS 表達(dá)的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時(shí)間延長,600、800 μmol/L 濃度組 ROS 表達(dá)顯著增強(qiáng)(見圖1、表1)。

        2.2 尿酸對(duì)HUVEC NO 含量的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時(shí)間延長,600、800 μmol/L 濃度組 NO 含量顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

        2.3 尿酸對(duì)eNOS 脫偶聯(lián)的影響 選擇前述試驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定的 600 μmol/L 尿酸濃度組,作用 HUVEC 48 h,高濃度的尿酸可以增加細(xì)胞內(nèi)ROS 水平,降低NO 含量及eNOSmRNA 表達(dá);加入 eNOS 抑制劑 L-NAME 之后,顯著降低由高尿酸所引起的細(xì)胞內(nèi)ROS 水平并增加NO 含量及eNOSmRNA表達(dá);差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

        3 討 論

        血管內(nèi)皮細(xì)胞通常是指覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層扁平上皮細(xì)胞,它形成血管的內(nèi)壁,是血管壁與血液之間的分界細(xì)胞,是血管腔內(nèi)血液與其他血管壁(如單層鱗狀上皮)的接口。它不但具有吞噬功能,是血管的保護(hù)膜,而且還是機(jī)體重要的內(nèi)分泌及旁分泌器官,參與免疫活動(dòng),包括調(diào)節(jié)血管舒張與收縮,調(diào)節(jié)凝血功能,防止血管通透性增加,緩解血管炎癥反應(yīng)等,維持著心血管系統(tǒng)的正常功能。內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)因素,是造成動(dòng)脈粥樣硬化性疾病高發(fā)生率和病死率的重要原因之一,其中的一個(gè)主要表現(xiàn)為內(nèi)皮舒張因子NO的生物利用度下降[6]。

        NO 是內(nèi)皮細(xì)胞重要的調(diào)節(jié)因子之一,主要由一氧化氮合酶(NOS)催化產(chǎn)生。NOS 是一種同工酶,有3 種不同亞型:神經(jīng)型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS),與心血管系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的是eNOS 和iNOS。eNOS 是調(diào)節(jié)NO 產(chǎn)生的主要限速酶,于1991 年由Forstermann 和Pollock在內(nèi)皮細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)。eNOS 源性的NO 發(fā)揮著調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能、維持血管平衡,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用。但是某些病理情況下,激活的eNOS 不再產(chǎn)生NO,而是形成超氧陰離子(),即 eNOS 出現(xiàn)脫偶聯(lián)狀態(tài),導(dǎo)致 NO 水平下降和水平升高。研究發(fā)現(xiàn),eNOS 脫偶聯(lián)可加重內(nèi)皮損傷,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與發(fā)展[7]。

        圖1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)(20×鏡下觀察,曝光時(shí)間2 s)

        表1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)(±s)

        表1 尿酸刺激HUVEC內(nèi)ROS表達(dá)(±s)

        時(shí)間24 h 48 h 72 h t值P值濃度200 μmol/L 1.82±1.35 1.99±1.62 2.37±1.88 3.624<0.05 400 μmol/L 2.19±1.27 2.22±1.34 2.63±1.51 4.008<0.05 600 μmol/L 2.45±1.49 2.95±1.38 3.41±1.08 4.649<0.05 800 μmol/L 3.94±1.05 4.41±1.38 5.04±1.64 4.811<0.05

        高尿酸血癥與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和內(nèi)皮功能受損密不可分。目前,國內(nèi)外有關(guān)尿酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能影響的研究不是很多,并且觀點(diǎn)存在較大差異。Papezikova I等[8]將尿酸與牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞作用24 h 后發(fā)現(xiàn)尿酸呈劑量依賴性降低了NO 的濃度,同時(shí)增加了ROS 的產(chǎn)生,損傷了血管內(nèi)皮細(xì)胞;Mishima M 等[9]通過激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,證明尿酸可以減少NO 的產(chǎn)生,引起炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激,損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞。這些均提示高尿酸血癥對(duì)心血管疾病有損害作用,但也有人提出相反意見。因此,為了解高尿酸血癥對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)在HUVEC 與不同濃度尿酸作用不同時(shí)間后,采用DHE熒光染色法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá),NO試劑盒檢測上清液中NO含量。結(jié)果顯示,隨著尿酸濃度的增加及作用時(shí)間的延長,尤其是600 μmol/L 以上尿酸濃度組,作用48 h 以上,HUVEC 上清液NO 含量顯著降低,ROS 表達(dá)強(qiáng)度顯著增加,表明高尿酸可以減少NO生成,激活氧化應(yīng)激反應(yīng),造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷,這與前面提到的試驗(yàn)結(jié)果一致。

        為了研究尿酸對(duì)eNOS脫偶聯(lián)的影響,筆者在分析比較了前述試驗(yàn)結(jié)果后,選擇結(jié)果較為穩(wěn)定的600 μmol/L 尿酸濃度組,加入eNOS 抑制劑L-NAME,作用48 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-NAME 可以降低由高尿酸所引起的細(xì)胞內(nèi)ROS水平并增加 NO 的含量及 eNOSmRNA 的表達(dá)。 L-NAME 是 eNOS 抑制劑,能夠阻止電子向L-Arg 或者是分子氧的傳遞,在正常內(nèi)皮細(xì)胞上,應(yīng)用L-NAME 抑制eNOS 電子向L-Arg 的傳遞,導(dǎo)致NO產(chǎn)生減少,而ROS水平反而增高;而當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞或者組織eNOS 發(fā)生脫偶聯(lián)時(shí),應(yīng)用L-NAME 后,可抑制電子向分子氧的傳遞,使得ROS 產(chǎn)生減少。因此采用L-NAME 觀察細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化,已成為評(píng)定eNOS脫偶聯(lián)的常用簡易方法[10]。

        圖2 尿酸刺激HUVEC后NO檢測

        圖3 高尿酸引起內(nèi)皮細(xì)胞eNOS脫偶聯(lián)

        因?qū)嶒?yàn)時(shí)間和器材的限制,本實(shí)驗(yàn)只是初步探討了尿酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及eNOS脫偶聯(lián)的影響,尚未涉及具體的信號(hào)通路。但我們的實(shí)驗(yàn)表明高尿酸血癥可以通過eNOS 脫偶聯(lián)使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。因此,逆轉(zhuǎn)由高尿酸引起的eNOS脫偶聯(lián)具有重要的科學(xué)意義,可為高尿酸誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的早期防治提供新的藥物作用靶點(diǎn),為深入研究人高尿酸血癥的致病機(jī)制及合理的干預(yù)措施提供初步證據(jù)。

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