刁力 李波

海陽市人民醫(yī)院 265100

高尿酸血癥是體內嘌呤代謝紊亂和尿酸排泄異常所致的血尿酸水平升高，已經成為一種常見病，不僅可以導致痛風、痛風性關節(jié)炎及痛風性腎病，其對心血管系統也有損傷作用，是心血管疾病的獨立危險因素［1］。近年來一些研究顯示高尿酸可刺激內皮細胞發(fā)生功能異常［2-4］，但具體機制尚不清楚。內皮細胞功能紊亂是動脈粥樣硬化發(fā)生的病理基礎，在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中扮演著重要作用［5］，對內皮細胞功能受損機制的研究已成為動脈粥樣硬化性疾病的研究熱點。本研究體外培養(yǎng)HUVEC，觀察不同濃度的尿酸對HUVEC的ROS水平、NO含量及eNOS mRNA表達的影響，了解尿酸對內皮損傷的作用途徑，以探討高尿酸血癥在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機制，對動脈粥樣硬化的防治有應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞（中心實驗室友情提供）；DMEM、0.25%胰酶/0.02%EDTA、胎牛血清（Hyclone 公司）；尿酸（Sigma 公司）；青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio 公司）；磷酸鹽緩沖液（Solarbio 公司）；eNOS 抑制劑L-NAME（Selleckchem 公司）；無水乙醇、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；PCR 引物（生工生物工程上海股份有限公司）；ROS 熒光探針-DHE（威格拉斯生物技術有限公司）；NO 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；總RNA 試劑盒（美國Omega 公司）；逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（天根生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 尿酸溶液的配置 1 ml NaOH 液體（1 mmol/L）中加入13.45 mg尿酸粉末，溶解后加至49 ml DMEM 完全培養(yǎng)基中，混勻過濾除菌至50 ml無菌離心管中，吸取300 μl測定其尿酸濃度，由所測結果調整至目標濃度1 600 μmol/L。以DMEM完全培養(yǎng)基稀釋尿酸原液至200、400、600、800 μmol/L。

1.2.2 HUVEC 的培養(yǎng)及試驗分組 （1）將凍存的HUVEC復蘇、培養(yǎng)，調整細胞計數為10×104于12孔板中，設置為5組：對照組（單純培養(yǎng)基組）、試驗組4組（分別為200、400、600、800 μmol/L 尿酸刺激組），各組分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，觀察尿酸對內皮細胞氧化應激的影響。（2）選擇結果較穩(wěn)定的600 μmol/L尿酸刺激組，設置為3組：對照組（單純培養(yǎng)基組）、試驗組（600 μmol/L 尿酸刺激組）、L-NAME干預組（100 μmol/L L-NAME預處理15 min，再與600 μmol/L尿酸溶液共同孵育48 h），觀察高尿酸對eNOS 脫偶聯的影響。以上每次實驗重復3板。

1.2.3 DHE 熒光染色法測定 ROS 水平 5 mmol/L 的DHE溶液加入12孔板中，熒光探針終濃度為5 μmol/L，恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察到有HUVEC 細胞的視野，以綠光激發(fā)，陰性對照孔下調整背景熒光強度，觀測并記錄不同濃度尿酸刺激后HUVEC 內的熒光強度。

1.2.4 上清液NO含量檢測 根據NO試劑盒說明書操作，測定細胞上清液NO 含量。每組3復孔。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達 提取細胞總RNA，測其純度與濃度。按天根公司KR106 FastQuant RT Ki 試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA。以eNOS為引物、β-action 為內參，按天根公司 FP205 SYBR Green 試劑盒說明書，Bio-Rad 儀進行熒光定量PCR 檢測eNOSmRNA 的表達。反應條件：95oC、15 min，95oC、10 sec，60oC、32 sec，循環(huán)40 次?！鳌鰿t=（目的基因Ct 值-內參 Ct值）試驗組-（目的基因Ct值-內參Ct值）對照組。試驗組目的基因對于對照組目的基因的表達量即為2-△△Ct。

1.3 統計學分析 統計學處理采用SPSS19.0軟件，數值以（±s）表示。多組間兩兩比較符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析（one-way ANOVA）Tukey 法，不符合正態(tài)分布的采用Dunnett法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 尿酸對HUVEC ROS 表達的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時間延長，600、800 μmol/L 濃度組 ROS 表達顯著增強（見圖1、表1）。

2.2 尿酸對HUVEC NO 含量的影響 隨著尿酸濃度升高及作用時間延長，600、800 μmol/L 濃度組 NO 含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，見圖2）。

2.3 尿酸對eNOS 脫偶聯的影響 選擇前述試驗結果較為穩(wěn)定的 600 μmol/L 尿酸濃度組，作用 HUVEC 48 h，高濃度的尿酸可以增加細胞內ROS 水平，降低NO 含量及eNOSmRNA 表達；加入 eNOS 抑制劑 L-NAME 之后，顯著降低由高尿酸所引起的細胞內ROS 水平并增加NO 含量及eNOSmRNA表達；差異有統計學意義（P＜0.05，見圖3）。

3 討 論

血管內皮細胞通常是指覆蓋于血管內膜表面的單層扁平上皮細胞，它形成血管的內壁，是血管壁與血液之間的分界細胞，是血管腔內血液與其他血管壁（如單層鱗狀上皮）的接口。它不但具有吞噬功能，是血管的保護膜，而且還是機體重要的內分泌及旁分泌器官，參與免疫活動，包括調節(jié)血管舒張與收縮，調節(jié)凝血功能，防止血管通透性增加，緩解血管炎癥反應等，維持著心血管系統的正常功能。內皮細胞功能紊亂是動脈粥樣硬化的始動因素，是造成動脈粥樣硬化性疾病高發(fā)生率和病死率的重要原因之一，其中的一個主要表現為內皮舒張因子NO的生物利用度下降［6］。

NO 是內皮細胞重要的調節(jié)因子之一，主要由一氧化氮合酶（NOS）催化產生。NOS 是一種同工酶，有3 種不同亞型：神經型（nNOS）、誘導型（iNOS）和內皮型（eNOS），與心血管系統疾病密切相關的是eNOS 和iNOS。eNOS 是調節(jié)NO 產生的主要限速酶，于1991 年由Forstermann 和Pollock在內皮細胞中首次發(fā)現。eNOS 源性的NO 發(fā)揮著調節(jié)內皮功能、維持血管平衡，預防動脈粥樣硬化的作用。但是某些病理情況下，激活的eNOS 不再產生NO，而是形成超氧陰離子（），即 eNOS 出現脫偶聯狀態(tài)，導致 NO 水平下降和水平升高。研究發(fā)現，eNOS 脫偶聯可加重內皮損傷，促進動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生與發(fā)展［7］。

圖1 尿酸刺激HUVEC內ROS表達（20×鏡下觀察，曝光時間2 s）

表1 尿酸刺激HUVEC內ROS表達（±s）

表1 尿酸刺激HUVEC內ROS表達（±s）

時間24 h 48 h 72 h t值P值濃度200 μmol/L 1.82±1.35 1.99±1.62 2.37±1.88 3.624＜0.05 400 μmol/L 2.19±1.27 2.22±1.34 2.63±1.51 4.008＜0.05 600 μmol/L 2.45±1.49 2.95±1.38 3.41±1.08 4.649＜0.05 800 μmol/L 3.94±1.05 4.41±1.38 5.04±1.64 4.811＜0.05

高尿酸血癥與動脈粥樣硬化的發(fā)展和內皮功能受損密不可分。目前，國內外有關尿酸對血管內皮細胞功能影響的研究不是很多，并且觀點存在較大差異。Papezikova I等［8］將尿酸與牛主動脈內皮細胞作用24 h 后發(fā)現尿酸呈劑量依賴性降低了NO 的濃度，同時增加了ROS 的產生，損傷了血管內皮細胞；Mishima M 等［9］通過激活人臍靜脈內皮細胞中的尿酸轉運體，證明尿酸可以減少NO 的產生，引起炎性反應及氧化應激，損傷血管內皮細胞。這些均提示高尿酸血癥對心血管疾病有損害作用，但也有人提出相反意見。因此，為了解高尿酸血癥對內皮細胞功能的影響及其機制，本實驗在HUVEC 與不同濃度尿酸作用不同時間后，采用DHE熒光染色法檢測細胞內ROS表達，NO試劑盒檢測上清液中NO含量。結果顯示，隨著尿酸濃度的增加及作用時間的延長，尤其是600 μmol/L 以上尿酸濃度組，作用48 h 以上，HUVEC 上清液NO 含量顯著降低，ROS 表達強度顯著增加，表明高尿酸可以減少NO生成，激活氧化應激反應，造成內皮細胞損傷，這與前面提到的試驗結果一致。

為了研究尿酸對eNOS脫偶聯的影響，筆者在分析比較了前述試驗結果后，選擇結果較為穩(wěn)定的600 μmol/L 尿酸濃度組，加入eNOS 抑制劑L-NAME，作用48 h，結果發(fā)現L-NAME 可以降低由高尿酸所引起的細胞內ROS水平并增加 NO 的含量及 eNOSmRNA 的表達。 L-NAME 是 eNOS 抑制劑，能夠阻止電子向L-Arg 或者是分子氧的傳遞，在正常內皮細胞上，應用L-NAME 抑制eNOS 電子向L-Arg 的傳遞，導致NO產生減少，而ROS水平反而增高；而當內皮細胞或者組織eNOS 發(fā)生脫偶聯時，應用L-NAME 后，可抑制電子向分子氧的傳遞，使得ROS 產生減少。因此采用L-NAME 觀察細胞內ROS水平的變化，已成為評定eNOS脫偶聯的常用簡易方法［10］。

圖2 尿酸刺激HUVEC后NO檢測

圖3 高尿酸引起內皮細胞eNOS脫偶聯

因實驗時間和器材的限制，本實驗只是初步探討了尿酸對血管內皮細胞氧化應激及eNOS脫偶聯的影響，尚未涉及具體的信號通路。但我們的實驗表明高尿酸血癥可以通過eNOS 脫偶聯使內皮細胞發(fā)生氧化應激從而導致內皮損傷。因此，逆轉由高尿酸引起的eNOS脫偶聯具有重要的科學意義，可為高尿酸誘導的動脈粥樣硬化性疾病的早期防治提供新的藥物作用靶點，為深入研究人高尿酸血癥的致病機制及合理的干預措施提供初步證據。