周國(guó)良，黃光耀，李盼，王宏志,3*，楊良保*

(1 中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)物理與技術(shù)中心，安徽合肥 230031;2 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽合肥 230026 3 中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院，安徽合肥 230031)

1 引言

腫瘤一直是威脅人類生命健康的重大疾病之一，全世界每年有1400多萬(wàn)新病例和800多萬(wàn)癌癥患者死亡。隨著醫(yī)療行業(yè)的不斷發(fā)展，抗腫瘤藥物方面的研究也有著巨大的進(jìn)步。但是一般的抗腫瘤藥物本身就帶有毒性，不僅僅對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生效果也會(huì)對(duì)自身的其他良好細(xì)胞造成一定的傷害，因此出現(xiàn)很多不良癥狀。5-FU是一種臨床應(yīng)用于結(jié)腸癌、直腸癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、頭頸部鱗癌、皮膚癌、肝癌、膀胱癌等的治療藥物[1]。它通過抑制DNA來控制腫瘤細(xì)胞的增殖，但是其治療劑量與中毒劑量[2]是相近的，因此建立一種快速有效的檢測(cè)5-FU藥物濃度的方法，確定5-FU安全有效的劑量，在臨床用藥方面具有重要意義。

目前，高效液相色譜(HPLC)[3]，已被廣泛應(yīng)用于全血5-FU的測(cè)定。雖然HPLC在靈敏度、準(zhǔn)確性以及精密度上有很大的優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)5-FU樣品的前處理過程復(fù)雜，回收率低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，同時(shí)也不利樣本的快速檢測(cè)。其次應(yīng)用較多的是液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)[4]。雖然上述常用方法在檢測(cè)5-FU中有很好

的應(yīng)用，但是存在不同程度的操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高和試劑保存時(shí)間短等諸多缺點(diǎn)，且操作人員需要較高的專業(yè)技術(shù)，有礙于該技術(shù)的推廣。因此，建立一種快速有效的方法來檢測(cè)5-FU，具有重要的意義。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)[5]是指當(dāng)分子吸附于某些粗糙的金屬(Ag、Au、Cu 等)表面或金屬納米顆粒表面時(shí)，吸附分子的散射截面會(huì)被金屬表面的局域電磁場(chǎng)劇烈放大，其拉曼散射強(qiáng)度會(huì)增加 104-108倍。SERS技術(shù)因快速靈敏、無損，具備分子指紋、專一性和單分子靈敏性的特點(diǎn)，能在分子水平上提供物質(zhì)、結(jié)構(gòu)的豐富信息，已逐漸成為化學(xué)、生物、環(huán)境、食品、藥物等領(lǐng)域一種強(qiáng)有力的檢測(cè)手段[6-11]。本文將利用種子生長(zhǎng)法合成的均一分散的銀納米顆粒[12]作為SERS基底，結(jié)合便攜式拉曼光譜儀器，開展 5-FU的檢測(cè)研究。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器設(shè)備

數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器(型號(hào)SZCL-2，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司)，超聲波清洗器(型號(hào)KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司)，低溫高速離心機(jī)(型號(hào)Sigmal1-16K，德國(guó)Sigma公司)，十萬(wàn)分之一電子天平(型號(hào)EX125DZH，奧豪斯儀器有限公司)，場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號(hào)FEI Sirion-200，日本島津公司)，紫外-可見分光光度計(jì)(型號(hào)UV-2550，日本島津公司)，便攜式拉曼光譜儀(型號(hào)Spk-2-0588，上海如海光電科技有限公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

氟尿嘧啶注射液(旭東海普藥業(yè)有限公司)，檸檬酸鈉(AR，上海國(guó)藥試劑公司)，結(jié)晶紫(AR，上海阿拉丁試劑有限公司)，氫氧化鈉(AR，上海國(guó)藥試劑公司)，雙氧水(AR，上海國(guó)藥試劑公司)，鹽酸(AR，上海國(guó)藥試劑公司)，硝酸(AR，上海國(guó)藥試劑公司)，硫酸(AR，上海國(guó)藥試劑公司)。

2.3 銀溶膠制備

通過種子生長(zhǎng)法合成均一分散的Ag NPs。首先合成種子溶液：將1 mL檸檬酸鈉溶液(1 wt %)，0.25 mL AgNO3水溶液(1 wt%)和0.2 mL NaCl水溶液(20 mM)依次加入1.05 mL水中，在室溫下攪拌預(yù)混合5分鐘后，將上述預(yù)混合物快速加入47.5 mL沸水中。加熱攪拌1 h后，將所得溶液冷卻至室溫，最終得到亮黃色的Ag NPs種子溶液。第二步：使用不同體積的種子溶液合成不同粒徑的Ag NPs。將2 mL AgNO3水溶液(1 wt %)與800 μL NH3·H2O混合(25～28%)制備銀氨溶液，用于Ag NPs的合成。將200 μL Ag NPs種子溶液添加到4.73 mL水中在室溫下攪拌。隨后，將70 μL銀氨溶液和AA水溶液(2 mL，2.5 mM)加入上述種子溶液中用與納米顆粒的生長(zhǎng)。攪拌1小時(shí)后，獲得粒徑約85 nm的Ag NPs。將上述溶液離心濃縮后，再分散于檸檬酸鈉水溶液(0.02 wt%)中保存?zhèn)溆??？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)種子溶液的量合成不同粒徑的Ag NPs。根據(jù)所得到的Ag NPs粒徑大小與粒子數(shù)濃度的關(guān)系，通過改變Ag NPs種子的數(shù)量，可以精確地調(diào)控Ag NPs的粒徑大小。此方法可以通過一鍋種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法在水中合成大尺寸跨度(從40到300 nm)的準(zhǔn)球形銀納米粒，不需要再使用額外的強(qiáng)穩(wěn)定劑，并不是多步驟種子介導(dǎo)生長(zhǎng)。利用Mie理論可以制備出不同尺寸和可預(yù)測(cè)消光譜的高質(zhì)量準(zhǔn)球形銀納米粒子，從而使我們能夠?qū)⑦@些尺寸不同的均勻銀納米粒子擴(kuò)展到不同的領(lǐng)域。研究結(jié)果還表明，形狀和尺寸分布窄(例如小于10%)的Ag NPs能夠在溶液中實(shí)現(xiàn)SERS信號(hào)的均勻性和再現(xiàn)性；在空間和時(shí)間尺度上，它們的RSD可以低至5%。因此，我們制備的形狀和尺寸均勻的銀納米粒子的方法可以實(shí)現(xiàn)溶液中SERS的定量測(cè)定。

2.4 SERS基底的制備

在進(jìn)行表征以及表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)之前需要制備SERS基底，將合成的銀納米顆粒進(jìn)行離心、濃縮處理。

2.5 銀納米顆粒粒徑的選擇和基底穩(wěn)定性研究

由于CV分子拉曼散射截面大，信號(hào)穩(wěn)定，能夠穩(wěn)定吸附在基底表面，因此選擇CV[13]作為探針評(píng)估SERS基底的增強(qiáng)效果以及穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中選擇CV(10-6M)對(duì)三種不同粒徑的Ag NPs的增強(qiáng)效果進(jìn)行對(duì)比，選擇增強(qiáng)效果最好的作為基底檢測(cè)5-FU。其次，滴加10 μL 10-6M的CV至篩選的基底表面，在室溫下自然干燥后，評(píng)估基底的穩(wěn)定性。

圖1 5-FU拉曼光譜圖和SERS圖Fig.1 Raman and SERS spectra of 5-FU

圖2 銀基底靈敏度和穩(wěn)定性研究圖譜Fig.2 Characterization of sensitivity and stability of SERS substrates

2.6 抗腫瘤藥物5-FU的SERS檢測(cè)

(1)5-FU的標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜:將5-FU注射液加入比色皿中，采集其拉曼光譜。結(jié)果如圖4。

(2)銀基底的背景信號(hào)采集:移取2 μL濃縮銀基底放到硅片上，用便攜式拉曼儀采集銀基底的信號(hào)，評(píng)估基底對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾。

(3)檢測(cè)不同濃度的5-FU:將配制的不同濃度5-FU與銀基底混合，然后用便攜式拉曼儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，激發(fā)功率為100 mw，積分時(shí)間為2 s。得到不同濃度5-FU的SERS光譜，并指認(rèn)5-FU的特征光譜譜帶。檢測(cè)結(jié)果如圖5。

2.7 血清中5-FU的檢測(cè)[14]

將不同濃度的5-FU加入血清中，搖勻混合，加入乙醇與血清混合(體積比3∶1)，沉淀去蛋白質(zhì)等干擾物。離心后取上清液與基底混合檢測(cè)，結(jié)果如圖7。

3 結(jié)果與討論

3.1 Ag NPs掃描電鏡表征和紫外-可見吸收光譜表征

對(duì)本實(shí)驗(yàn)所制備的Ag NPs進(jìn)行掃描電鏡測(cè)試。將離心再分散后的Ag NPs滴在干凈的硅片上，待其自然變干后，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。圖3A、B、C是不同粒徑Ag NPs的電鏡掃描圖。根據(jù)掃描電鏡對(duì)其形貌表征結(jié)果可知：通過調(diào)節(jié)種子的量，可以獲得粒徑約60～80 nm之間的納米顆粒，且顆粒排列有序，無明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖3 不同粒徑Ag NPs的光學(xué)照片、掃描電鏡圖以及紫外-可見吸收光譜圖。Fig.3 Optical photographs,Scanning electron microscopy (SEM) and ultraviolet-visible absorption spectra of Ag NPs with different diameter

對(duì)制備的銀納米顆粒進(jìn)行紫外表征。取一定量的Ag NPs加入到比色皿中，用紫外可見分光光度計(jì)采集400 nm～800 nm之間Ag NPs的吸收峰。納米粒子的大小、形貌不同，會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生吸收峰的位置有所不同，因此可以通過紫外可見吸收光譜反映其形貌顆粒大小等特點(diǎn)。通過上圖可以觀察到本實(shí)驗(yàn)制備的銀納米顆粒在488、468、460 nm 處有吸收峰。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，粒徑分布在60～80 nm之間，與SEM結(jié)果一致。

3.2 銀基底的篩選

圖4A-C分別是700 μL、1000 μL和1200 μL種子溶液合成的Ag NPs對(duì)10-6M CV的檢測(cè)結(jié)果。如圖所示，不同粒徑的Ag NPs均可以實(shí)現(xiàn)CV分子的可靠檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中以1602 cm-1的強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。如圖D所示，通過三種不同粒徑的Ag NPs對(duì)CV檢測(cè)的特征峰強(qiáng)度對(duì)比。700 μL種子溶液合成的Ag NPs(粒徑80左右)對(duì)CV的增強(qiáng)效果最好。因此，選用銀納米粒子作為SERS基底對(duì) 5-FU進(jìn)行檢測(cè)。

圖4 不同粒徑銀納米粒子的增強(qiáng)效果對(duì)比圖Fig.4 Comparison of Enhancement Effect of Silver Nanoparticles with Different Diameter

3.3 銀基底的重復(fù)性表征

基底的重復(fù)性是SERS基底可靠性的重要參數(shù)之一。為了考察銀基底的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)中選擇10-6MCV作為探針分子評(píng)估基底重復(fù)性。只有基底具有較好的重復(fù)性，才能保證SERS信號(hào)的穩(wěn)定性。CV是一種三苯甲烷類分子，拉曼活性高，在可見區(qū)域有明顯的電子吸收光譜。如圖3A所示，在基底表面隨機(jī)采集30條光譜，SERS光譜表現(xiàn)出較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。1585 cm-1和1616 cm-1歸屬于苯環(huán)伸縮振動(dòng)分裂；1370 cm-1歸屬于C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)和N-C-環(huán)-C-C對(duì)稱伸縮振動(dòng)疊加而成；1173 cm-1歸屬于苯環(huán)上C-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)模式；915 cm-1歸屬于C-H面外彎曲振動(dòng)模式；803 cm-1歸屬于C-N-C對(duì)稱伸縮振動(dòng)模式。實(shí)驗(yàn)中以特征峰1616 cm-1強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，量化基底的均一性。如圖3B和3D所示，基底的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%左右，因此基底的均一性較好，為后期SERS信號(hào)的穩(wěn)定性和重復(fù)性提供了保障?；谏鲜鯯ERS譜圖，可以初步說明Ag NPs基底對(duì)待測(cè)物能夠進(jìn)行信號(hào)放大。

3.4 5-FU標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖和SERS圖

圖A為5-FU標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜圖，770 cm-1拉曼光譜為嘧啶環(huán)振動(dòng)，拉曼儀的設(shè)置條件為：波長(zhǎng)為785 nm、功率為100 mw、積分時(shí)間2 s。

圖B為5-FU(25 mg/L)的SERS光譜。通過文獻(xiàn)調(diào)研，5-FU的特征峰歸屬如下:1234 cm-1的譜帶歸屬于C-F 伸縮振動(dòng)；1340 cm-1歸屬于C-H 伸縮振動(dòng)；1400 cm-1歸屬于N-H 伸縮振動(dòng)；1672 cm-1歸屬于C=O 伸縮振動(dòng)。

圖A的拉曼光譜圖與圖B的SERS光譜圖差異較大，可能是因?yàn)榉肿优c金屬表面之間強(qiáng)烈的化學(xué)作用，可能導(dǎo)致分子的對(duì)稱性甚至電子結(jié)構(gòu)的改變。這種效應(yīng)導(dǎo)致相對(duì)強(qiáng)度的變化和頻移。這種差異還由金屬表面電磁場(chǎng)決定的表面選擇規(guī)則。

3.5 不同濃度5-FU的SERS檢測(cè)圖譜

圖5為不同濃度的5-FU以及基底的SERS光譜，圖A中5-1分別是25 μg/mL、12.5 μg/mL、2.5 μg/mL、0.25 μg/mL 5-FU的SERS特征峰以及銀基底的空白背景峰。根據(jù)圖A可以得知，5-FU的特征峰不受基底信號(hào)影響。圖B為四種不同濃度5-FU在1234cm-1特征峰處的強(qiáng)度對(duì)比圖。

圖5 不同濃度的5-FU SERS檢測(cè)譜圖Fig.5 SERS Spectra of 5-FU with Different Concentrations

由圖B的特征峰強(qiáng)度對(duì)比可得：5-FU濃度越高，特征峰越強(qiáng)，目前5-Fu的檢測(cè)限為0.25 μg/mL。

3.6 血清中的5-FU的SERS檢測(cè)

將5-FU按照標(biāo)準(zhǔn)加入法加入到血清中，配制不同濃度5-FU的血清溶液。根據(jù)優(yōu)化的前處理技術(shù)，取40 μL 血清與120 μL乙醇混合，由于乙醇與水的親和力大，破壞了蛋白質(zhì)表面的水滑坡，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度降低，引起蛋白質(zhì)沉淀。1為銀基底的光譜，2為血清的光譜，3～5分別為血清去除蛋白質(zhì)后，31.25 μg/mL、15.625 μg/mL和3.125 μg/mL 5-FU的特征光譜。如圖所示，純化蛋白之后，血清的特征峰對(duì)5-FU的檢測(cè)不產(chǎn)生干擾。血清中5-FU的檢測(cè)限為3.125 μg/mL。

圖6 血清中不同濃度5-FU SERS檢測(cè)譜圖Fig.6 SERS Spectra of 5-FU with different concentrations spiked in serum

4 結(jié)論

本研究建立了SERS快速檢測(cè)血清中5-FU的方法，利用種子生長(zhǎng)法制備粒徑約為80 nm Ag NPs，通過CV分子評(píng)估銀基底的增強(qiáng)能力?；椎腞SD小于10%，結(jié)果表明種子生長(zhǎng)法合成的Ag NPs，粒徑均一且增強(qiáng)效果以及穩(wěn)定性較好。對(duì)不同濃度5-FU標(biāo)品進(jìn)行SERS檢測(cè)，檢測(cè)限為0.25 μg/mL。針對(duì)血清中5-FU檢測(cè)，利用乙醇沉淀去除蛋白，降低檢測(cè)干擾，實(shí)現(xiàn)了血清中3.125 μg/mL 5-FU的靈敏檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)單，十分鐘內(nèi)能完成檢測(cè)，有望應(yīng)用于其他抗腫瘤藥物的分析測(cè)定，為臨床給藥提供新的技術(shù)支撐。