（中南林業(yè)科技大學 a.林學院；b.水土保持與荒漠化重點實驗室，湖南 長沙 410004）

閩楠Phoebe bournei(Hemsl.) Yang 是中國傳統(tǒng)珍貴用材樹種和優(yōu)良園林綠化樹種，已被列入了國家重點發(fā)展的南方集林區(qū)珍貴用材樹種和國家戰(zhàn)略儲備林樹種之一[1]。土壤微生物群落結構和多樣性直接影響土壤理化性質及土壤養(yǎng)分的組成與轉化[2]。土壤細菌對土壤環(huán)境質量的變化高度敏感，常被用來評價農林復合生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境變化[3]，土壤細菌群落結構和多樣性的變化特征在生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)中起著關鍵作用，影響著植被的發(fā)育和演替[4]。土壤微生物作為熱點問題，已成為近年來國內外土壤學研究的熱點之一。人工林年齡的變化對土壤微生物多樣性[5]和微生物群落結構[6]有很強的影響。王超群等[7]對不同林齡杉木人工林土壤微生物群落代謝功能差異進行研究，結果表明0～20 cm 土層土壤微生物群落的代謝活性、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、McIntosh 多樣性指數(shù)和McIntosh 均勻度指數(shù)均隨林齡的增加而增加。牛小云等[8]通過對遼寧不同林齡日本落葉松人工林土壤微生物、養(yǎng)分及酶活性進行研究，結果表明土壤微生物、養(yǎng)分及酶活性各項指標基本呈現(xiàn)11 或47 a 林齡較高，20 或34 a 林齡較低，且隨著林齡增加土壤微生物群落結構及酶活性變化呈減小的趨勢。此外，土壤中細菌群落結構受土壤理化性質的驅動，有機質與土壤微生物群落結構之間存在很強的關聯(lián)性[9]，土壤中的氮磷鉀元素是影響細菌群落組成的主要因素[10]。目前，隨著人工林年齡增長，土壤微生物方面的研究在桉樹[11]、松樹[12]和杉木[13]等速生樹種中研究較多，而關于閩楠人工林的研究，大多集中在對閩楠人工林的生物量[14]和碳密度[15]，優(yōu)良家系的培育、育苗技術[16-17]和遺傳改良[18]及其生長特性等方面[19-20]，對于不同林齡閩楠人工林微生物群落結構和多樣性，及其與土壤化學性質的研究卻很少被關注。本研究選擇5年生、10年生、15年生和40年生閩楠人工林作為研究對象，通過Illumina HiSeq 高通量技術和冗余分析的方法探究不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落結構和多樣性的演變特征及其與化學性質的關系，旨在揭示細菌群落結構和多樣性對不同林齡閩楠人工林的響應機制，找出影響土壤細菌群落結構和多樣性的最敏感的環(huán)境因子，以期為促進閩楠人工林土壤質量的改善，以及閩楠人工林高效可持續(xù)經(jīng)營提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于湖南永州市金洞林場（110°53′25″—112°13′17″E，26°2′33″—26°21′25″N）。屬于中亞熱帶東南季風濕潤氣候區(qū)，年均降水量為1 600～1 900 mm，年平均氣溫16.3～17.7℃，年均日照時間1 300～1 740 h，無霜期293 d。土壤類型為第四紀紅壤和黃壤，成土母巖以砂巖、頁巖、碳質板巖為主。研究區(qū)內森林覆蓋率達86%，林木蓄積達2.98×106m3，林場境內森林茂盛，物種多樣，據(jù)調查有高等植物210 科，1 557 種，屬國家保護植物銀杏、紅豆杉、鐘萼木、傘花木、吉赤皮青岡、古圓櫧、古楠木等56 種。

1.2 樣地設置與樣品的采集

分別選擇坡度、坡向、海拔、土壤和地形等立地因子相同或相似的不同林齡閩楠人工林試驗樣地，分別為：5年生閩楠幼齡林（Y5）、10年生閩楠中齡林（Y10）、15年生閩楠近熟齡林（Y15）和40年生閩楠成熟林（Y40）。在每個林齡分上坡、中坡和下坡設置3 塊20 m×20 m 的標準地，共12塊標準地，并對樣地內林木進每木檢尺，測定胸徑、樹高，調查樣地的地形地貌、土壤類型、群落結構及林下植被進行調查。樣地基本概況見表1。

土壤樣品采集于2019年3月中旬，在每塊標準樣地內采用“S”布點采取土壤樣品，取18 個土芯（直徑5 cm），取去除土壤表層的腐殖質及雜質后的0～20 cm 的土樣混合成一個復合樣品。然后利用四分法將土壤分為4 份取其中一份，每一個林齡總共有3 個復合樣品。從每一個取出的復合樣品中，取大約10 g 去除根和石子的新鮮土過2 mm 篩，放入滅菌后的離心管中并立即放入液氮中用于16 Sr DNA 分析，到達實驗室后樣品保存在零下80 ℃的冰箱中，其余的新鮮土（約500 g）自然風干后過2 mm 的篩用于化學性質的測定。

表1 不同林齡階段閩楠人工林樣地基本概況Table 1 Basic overview of the plantation of Phoebe bournei in different stages of forest ages

1.3 土壤化學性質的測定

土壤pH 值采用水土比2.5:1 的酸度計法；有機碳（SOC）采用高鉻酸鉀高溫外加熱法；全氮（TN）采用凱氏定氮法；全磷（TP）和全鉀（TK）采用氫氧化鈉熔融法；堿解氮（AN）采用堿解擴散法；土壤有效P（AP）、速效K（AK）采用Mehlich3浸提液－原子吸收分光光度計法。

1.4 DNA 提取及細菌16S rDNA PCR 擴增及測序技術

土壤總DNA 采用CTAB 方法對樣本的基因組DNA 進行提取之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，使用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋后的基因組DNA 為模板，16srdnav3-v4 區(qū)引物為341F (CCTAYGGGRBGCASCAG)-806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)，進行PCR 擴增。酶和緩沖液使用New England Biolabs 公司的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶進行PCR，確保擴增效率和準確性。PCR 反應體系和程序（30 μL）：Phusion Master Mix（2×）15 μL；Primer（2 μmol）3 μl（6 μmol）；gDNA（1 ng/μL）10 μL（5～10 ng）H2O2μL 反應程序：98℃預變性1 min；30 個循環(huán)（98℃，10 s；50℃，30 s；72℃，30 s）；72℃，5 min。采用Bio-radT100 梯度PCR 儀進行分析，PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣，充分混勻后使用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物，選擇主帶大小在400～450 bp 之間的序列，割膠回收目標條帶。產(chǎn)物純化試劑盒使用的是Thermo Scientific公司GeneJET膠回收試劑盒。

1.5 細菌多樣性分析

使用Qiime 軟件（Version 1.7.0）計算Shannon均勻度指數(shù)、Simpson 均勻度指數(shù)、Ace 豐富度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

統(tǒng)計方法采用Microsoft Excel 2016、SPSS20.0和Canoco 5.0 數(shù)據(jù)處理軟件，并進行ANOVA 單因素方差分析，采用LSD 差異顯著性檢驗比較不同林齡閩楠人工林土壤化學性質和微生物多樣性的差異，利用冗余分析（RDA）揭示土壤化學性質與微生物群落結構和多樣性的相互關聯(lián)機制。

2 結果與分析

2.1 不同林齡閩楠人工林土壤化學性質的差異

土壤pH 值、有機碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀在不同林齡閩楠人工林之間均存在顯著差異（P＜0.05），而有效磷在不同林齡閩楠人工林之間差異性不顯著（P=0.185）（表2）。其中，土壤pH 值、有機碳、速效鉀含量隨著林齡增加先增高后下降，在15年生時最高，分別為4.09、23.55 g/kg 和150.50 mg/kg。全氮的含量隨著林齡增加先增高后下降再增高的趨勢，在10年生時最高為3.16 g/kg。全磷的含量總體上隨著林齡增加而增高，在40年生時最高為0.98 g/kg。全鉀的含量隨著林齡增加先下降后增高，在5年生時最高為7.45 g/kg。堿解氮的含量隨著林齡增加呈現(xiàn)先下降后增高再下降的趨勢，在15年生時最高為158.23 mg/kg。閩楠人工林土壤類型主要屬于酸性紅壤（pH 值＜4.5）。

2.2 不同林齡閩楠人工林土壤細菌測序數(shù)據(jù)分析

16S rDNA 檢測表明，在97%的相似水平下，隨著林齡增加OTUs 平均個數(shù)先增高后下降，在10年生時最高為3 179 個，5年生時最小為2 755個，12 個樣品共34 998 個OTUs 被測出，每個樣品范圍為1 939～2 420，平均OTU 個數(shù)2 142 個。樣品共得到616 646 條序列數(shù)，各個樣品的有效序列長度一般在411 bp 左右，文庫覆蓋率范圍為98.94%～99.52%，說明樣品基因序列被檢出的概率很高，能夠反映檢測樣品土壤細菌群落的真實情況（表3）。12 個樣品的曲線趨向平坦時，說明測序數(shù)據(jù)量漸進合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的OTUs（圖1）。

表3 不同林齡閩楠人工林土壤細菌測序數(shù)據(jù)Table 3 Sequencing data of soil bacteria in different ages of Phoebe bournei

圖1 OUT 稀釋曲線Fig.1 OUT dilution curve

2.3 不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落組成和結構分析

不同林齡閩楠人工林細菌群落組成存在顯著差異，尤其是5年生和10年生閩楠人工林差異最為顯著（圖2）。主坐標分析（PCoA）結果顯示，PC1 的貢獻率為41.21%，PC2 的貢獻率為23.75%，兩者共解釋了64.96%。從樣點的細菌群落組成來看，在PC1 中，5年生、15年生和10年生閩楠人工林細菌群落組成差異較大，尤其是5年生和10年生閩楠人工林差異最為顯著，而40年生與10年生和15年生閩楠人工林細菌群落組成差異不顯著；在PC2 中，15年生和10年生閩楠人工林細菌群落組成差異較大，而40年生和5年生閩楠人工林細菌群落組成差異不顯著。

圖2 土壤細菌OTU 主坐標分析Fig.2 Analysis of the main coordinates of soil bacteria OTU

對OTU 代表序列進行物種注釋并歸類，12個樣品共識別出21 門，43 綱，88 目，153 科，204 屬和395 種。12 個樣品的土壤細菌門分類群落餅圖顯示：排名前10 主要菌門中，變形菌門（Proteobacteria）（30.87%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（26.98%）、綠彎菌門（Chloroflexi）（16.49%）、放線菌門（Actinobacteria）（9.80%）為主要菌門（圖3）。同時，根據(jù)不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落優(yōu)勢菌門相對豐度的熱圖顯示：細菌群落菌門的相對豐度在不同林齡條件下存在差異，且各菌門的差異性均不相同（圖4）。

圖3 林齡閩楠人工林土壤細菌門分類群落餅Fig.3 Soil bacterium gate classification community pie chart of Pinnacle sinensis plantation

不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落的相對豐度在門水平下綠彎菌門、厚壁菌門和GAL15 均有顯著性差異（P＜0.05），而在變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和衣原體中無顯著性差異（P＞0.05，表4）。其中，綠彎菌門和GAL15 的相對豐度隨著林齡增加呈現(xiàn)先增高后下降再增高的趨勢，在10年生時最高，分別為23.47%和1.49%，顯著高于5年和15年生閩楠人工林，厚壁菌門的相對豐度隨著林齡增加總體呈下降的趨勢，在5年生時最大為3.69%，顯著高于15年和40年生閩楠人工林。此外，變形菌門在15年生閩楠人工林中含量最豐富，酸桿菌門和綠彎菌門在10年生閩楠人工林中含量最豐富，而浮霉菌門和厚壁菌門在5年生閩楠人工林中含量最豐富，放線菌門在40年生閩楠人工林中含量最豐富（圖5）。

2.4 不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落多樣性分析

不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落多樣性Shannon 均勻度指數(shù)、Simpson 均勻度指數(shù)、Ace豐富度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)均存在顯著差異（P＜0.05，表5），其中Simpson 均勻度指數(shù)和Ace 豐富度指數(shù)隨著林齡增加呈現(xiàn)先下降后增高再下降的趨勢，在15年生時最高，分別為0.24和32.31。Shannon 均勻度指數(shù)隨著林齡增加呈現(xiàn)先增高后下降再增高的趨勢，在10年生時最高為1.92。Chao1 豐富度指數(shù)隨著林齡增加先增高后下降，在15年生時最高為26.33。

2.5 土壤細菌群落結構和多樣性與化學性質的冗余分析

蒙特卡洛檢驗表明土壤化學性質與優(yōu)勢細菌菌門的相對豐度顯著相關（P＜0.05），其中，有機碳、有效鉀和全磷與土壤細菌群落結構相關性較強。第一主軸解釋了62.89%的變化，第二主軸解釋了23.93%的變化，兩者共解釋了86.82%的變化。有機碳、有效鉀和全磷與RDA1 正相關性最強，主要表現(xiàn)在：其與芽單胞菌門、變形菌門和放線菌門較強的正相關，與厚壁菌門、酸桿菌門、疣微菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門較強的負相關性。堿解氮和全鉀與RDA2正相關性最強，主要表現(xiàn)在：其與浮霉菌門、變形菌門和放線菌門較強的正相關，與GAL15 和綠彎菌門較強的負相關性。此外，全氮與RDA2 負相關性最強，其與土壤主要優(yōu)勢菌門的相關性與堿解氮和全鉀的相反（圖6）。

圖4 不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落優(yōu)勢菌門相對豐度的熱圖Fig.4 Heat map of the relative abundance of dominant bacterial species in soil bacterial communities of different ages of Phoebe bournei

表4 不同林齡閩楠人工林土壤優(yōu)勢細菌菌門的相對豐度Table 4 Relative abundance of dominant bacteria in the soil of different ages of Phoebe bournei

蒙特卡洛檢驗表明土壤化學性質與優(yōu)勢細菌菌門的相對豐度顯著相關（P＜0.05），其中，有機碳、有效鉀和全磷與土壤細菌群落多樣性相關性較強。第一主軸解釋了66.15%的變化，第二主軸解釋了21.62%的變化，兩者共解釋了86.77%的變化。有機碳、有效鉀和全磷與RDA1 正相關性最強，主要表現(xiàn)在：其與Simpson 均勻度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)較強的正相關，與Ace 豐富度指數(shù)和Shannon 均勻度指數(shù)較強的負相關性。堿解氮和全鉀與RDA2 正相關性最強，主要表現(xiàn)在：其與Ace 豐富度指數(shù)、Simpson 均勻度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)的較強正相關，與Shannon 均勻度指數(shù)較強的負相關性。此外，全氮與RDA2 負相關性較強，其與土壤細菌多樣性指數(shù)的相關性與堿解氮和全鉀的相反（圖7）。

圖5 不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落優(yōu)勢菌門相對豐度分布Fig.5 Relative abundance distribution of dominant bacteria in soil bacterial communities of different ages of Phoebe bournei

表5 不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落多樣性差異Table 5 Differences in soil bacterial community diversity in different plantations of Pinus sylvestris

3 討 論

3.1 林齡對閩楠人工林土壤化學性質的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，不同林齡閩楠人工林土壤pH值、有機碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀均存在顯著差異，其中15年生閩楠人工林有機碳、堿解氮和速效鉀的含量顯著高于其它林齡，而5年生閩楠人工林的有機碳、全氮、全磷和速效鉀的含量顯著低于其它林齡，這表明閩楠人工林在不同的發(fā)育周期，其土壤肥力質量變化比較大，在經(jīng)營的過程中更應該注重施肥等管理措施。然而隨著閩楠人工林的持續(xù)種植，40年生閩楠人工林土壤有機質、堿解氮和速效鉀的含量顯著小于15年生，這可能是由于持續(xù)經(jīng)營方式不斷消耗土壤地力，而在目前的經(jīng)營方式下并未及時補充營養(yǎng)元素，僅靠凋落物分解難以維持林地的持續(xù)經(jīng)營。胡士達[21]對不同林齡閩楠人工林生態(tài)化學計量特征的研究表明土壤中有機碳碳、全氮含量均表現(xiàn)為14 a＞60 a＞45 a，14 a 和60 a 顯著高于45 a；全磷含量表現(xiàn)為45 a＞60 a＞14 a，這與本研究的研究結果相一致。此外，5 a 到10 a，土壤有機碳、全氮和速效鉀均呈顯著增加的趨勢，而全鉀和堿解氮呈顯著減小的趨勢；10 a 到15 a，土壤有機碳、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀均呈顯著增加的趨勢，而全氮呈顯著減小的趨勢；15～40 a，土壤全磷呈顯著增加的趨勢，而有機碳、堿解氮和速效鉀全氮均呈顯著減小的趨勢，這可能是由于閩楠不同的生長發(fā)育周期，其對土壤元素的吸收利用效率不同導致的，而且這種利用機制的不同，導致土壤養(yǎng)分的不均勻效應。大量研究表明，不同樹種在不同林齡類型下，土壤養(yǎng)分元素的增加和減小的趨勢并不一致[22-23]。此外，在不同林齡條件下，土壤有效磷的含量無顯著性差異，可能是由于在酸性土壤中極易形成磷酸鹽沉淀，這也通常是亞熱帶酸性土壤中磷的有限性的限制性因子。

3.2 林齡對閩楠人工林土壤細菌群落結構和多樣性的影響

大量研究表明，隨著森林種植林齡的增加土壤微生物群落結構會發(fā)生巨大影響[24]。在本研究中，不同林齡閩楠人工林細菌群落組成存在顯著差異，尤其是5年生和10年生閩楠人工林差異最為顯著。這可能是由于隨著林分的增加植物—土壤之間的交互作用發(fā)生改變，導致植物生理生化機制進行不同類型的分化，及其與土壤的適應和相互協(xié)調能力的改變，從而導致土壤微生物群落結構的差異[25]。同時，本研究檢測出變形菌門（30.87%）、酸桿菌門（26.98%）、綠彎菌門（16.49%）和放線菌門（9.80%）為閩楠人工林的主要優(yōu)勢菌門，其中綠彎菌門、厚壁菌門和GAL15 在不同林齡條件下存在顯著差異（P＜0.05）。隨著林齡增加土壤微生物群落結構變化的差異與徐志霞等[26]的結果相似。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，不同林齡閩楠人工林土壤細菌群落多樣性Shannon 均勻度指數(shù)、Simpson 均勻度指數(shù)、Ace 豐富度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)均存在顯著差異（P＜0.05），其中，15年生閩楠人工林細菌多樣性指數(shù)Simpson 均勻度指數(shù)、Ace 豐富度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)均顯著高于其它林齡類型。這一結果說明隨著林齡的增加，15年生閩楠人工林土壤細菌多樣性指數(shù)達到了較高的水平，而在40年生閩楠人工林中土壤細菌多樣性指數(shù)有所下降。

本研究中，測量的土壤化學因子分別解釋了土壤微生物群落結構和多樣性總變異系數(shù)的86.82%和86.77%，這表明土壤微生物的群落結構和多樣性更容易受到土壤化學性質的影響，其通過微生物的呼吸，礦化和反硝化等代謝活動來調節(jié)地球的化學環(huán)境。我們的研究結果中，隨著林齡的增加，土壤pH 值、有機碳、全氮、全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀含量均呈現(xiàn)不同程度的增加或減少，土壤化學性質的變化可能是導致土壤微生物群落結構和多樣性發(fā)生明顯變化主要原因。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)有機碳、有效鉀和全磷與土壤細菌群落結構和多樣性顯著相關，表明土壤有機碳、有效鉀和全磷可能是影響閩楠人工林土壤中微生物活動的重要因素。大量研究表明，微生物生長和活性通常受土壤有機碳，氮和磷的有效性的限制[27]，而本研究中有機碳、有效鉀和全磷是閩楠人工林土壤微生物生長的關鍵因子，與微生物群落結構和多樣性密切相關。因此，在確定閩楠人工林土壤微生物群落結構和多樣性中土壤環(huán)境因子的影響值得進一步研究，以了解如何更好地利用微生物，改善土壤環(huán)境，提高其在森林土壤環(huán)境的利用效率。此外，本研究僅對不同林齡閩楠人工林土壤真菌進行探討分析，而未涉及真菌和土壤微生物功能多樣性的探討，在接下來的研究中重點是應該將土壤微生物細菌、真菌結構和多樣性進行結合探討，并與土壤微生物功能多樣性進行銜接，以期更加深入了解閩楠人工林土壤微生物的演變對林齡的響應機制，同時本研究擬為閩楠人工林在以后新型肥料的研發(fā)提供一定的參考意見。

4 結 論

研究結果表明不同林齡閩楠人工林土壤化學性質、微生物群落結構和多樣性均存在顯著差異。隨著林齡的增加，15年生閩楠人工林有機碳、堿解氮和速效鉀的含量達到較高的水平，而隨著林齡增加到40 a，土壤有機碳、堿解氮和速效鉀全氮均呈顯著減小的趨勢。微生物群落結構和多樣性在不同林齡閩楠人工林樣地中具有顯著差異，本研究檢測出變形菌門（30.87%）、酸桿菌門（26.98%）、綠彎菌門（16.49%）和放線菌門（9.80%）作為閩楠人工林的主要優(yōu)勢菌門，其中綠彎菌門和GAL15 均在10年生閩楠人工林中的相對豐度顯著高于5年和15年生，厚壁菌門在5年生閩楠人工林中的相對豐度顯著高于15年和40年生。閩楠人工林細菌多樣性指數(shù)Simpson 均勻度指數(shù)、Ace 豐富度指數(shù)和Chao1 豐富度指數(shù)均表現(xiàn)為15年生顯著高于其它林齡類型。此外，從研究的土壤環(huán)境因子的范圍來看，有機碳、有效鉀和全磷是影響土壤微生物群落結構和多樣性的關鍵決定性因素。因此，在進行閩楠人工林培育和種植的過程中，應該關注土壤微生物的演變特征，及其與土壤環(huán)境因子的相互作用機制，以期為閩楠人工林的高效經(jīng)營以及以后新型肥料的研發(fā)提供一定的參考意見。