陳君逸，劉向一，徐迎勝，樊東升

北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100191

肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）是一種進(jìn)行性致死性神經(jīng)變性病，主要累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，患者多于發(fā)病3～5年內(nèi)死于呼吸衰竭，病因尚不明確，缺乏有效治療方法［1］。因此，ALS病因研究對于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。現(xiàn)有研究顯示遺傳因素對ALS發(fā)病有重要作用［2］，1993年超氧化物歧化酶1（SOD1）基因被報(bào)道與家族性ALS相關(guān)［3］，是最早被發(fā)現(xiàn)的ALS致病基因，迄今已發(fā)現(xiàn)至少120個(gè)基因變異與ALS發(fā)病相關(guān)［2］。近年來隨著大規(guī)模平行測序技術(shù)的發(fā)展，如全基因組測序及全外顯子組測序，越來越多的ALS致病新基因被發(fā)現(xiàn)，包括TBK1、CHCHD10、TUBA4A、MATR3等［4］。但仍有許多ALS相關(guān)遺傳風(fēng)險(xiǎn)變異未被發(fā)現(xiàn)，并且這些極有可能是罕見變異［5］，推測尚有許多未被發(fā)現(xiàn)的致病基因罕見變異與ALS相關(guān)。

HSPB1基因，位于7q11.23，編碼小分子量熱休克蛋白家族成員B1（HSPB1），該基因突變可導(dǎo)致常染色體遺傳的軸索性神經(jīng)病，包括腓骨肌萎縮癥2F型（CMT 2F）和遠(yuǎn)端型遺傳性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)?。╠HMN）［6-9］，患者的臨床表現(xiàn)可能與ALS類似?；A(chǔ)研究顯示HSPB1在SOD1-ALS動(dòng)物模型中表達(dá)上調(diào)［10］，且對SOD1致病性突變誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用［11-12］，在ALS患者脊髓組織中HSPB1表達(dá)明顯增多［13］，提示HSPB1基因可能與ALS發(fā)病相關(guān)。但檢索Pubmed僅見一項(xiàng)基于意大利ALS隊(duì)列的研究顯示HSPB1可能參與散發(fā)性ALS致病過程［14］，國內(nèi)外未見其他相關(guān)臨床研究，目前HSPB1基因是否與ALS發(fā)病存在關(guān)聯(lián)尚未證實(shí)。

本研究通過二代測序技術(shù)對166例中國ALS患者進(jìn)行了基因檢測，篩選出HSPB1基因可能的致病性罕見變異，分別比對千人計(jì)劃（1000 Genome）及中國國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫進(jìn)行關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)，以明確HSPB1基因罕見變異與ALS發(fā)病的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 研究對象

納入2018年1月～2020年7月就診于我院并進(jìn)行二代測序基因檢查的ALS患者166例。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2000年修訂的EI Escorial標(biāo)準(zhǔn)［15］診斷符合確診、擬診、實(shí)驗(yàn)室支持?jǐn)M診及可能的ALS；同意并進(jìn)行了二代測序基因檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：類ALS綜合征；不同意行基因檢查。收集每個(gè)研究對象的臨床資料，包括性別、發(fā)病年齡、起病部位、家族史、神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征、肌電圖結(jié)果等，并進(jìn)行ALS功能評分量表-修訂版（ALSFRS-R）評分。其中家族性ALS 33例，散發(fā)性ALS 133例；男性104例（62.7%），女性62例（37.3%），男女比例為1.68:1；發(fā)病年齡43.8±12.2歲；肢體起病142例（85.5%），球部起病21例（12.7%），胸段起病3例（1.8%）。以千人計(jì)劃（2504個(gè)樣本，http://www.internationalgenome.org/home）和國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫（1812個(gè)樣本，http://www.kangso.net.cn/index.html）作為對照。本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，全部研究對象均簽署了知情同意書。

1.2 基因檢測

應(yīng)用二代測序技術(shù)對入組的ALS患者進(jìn)行了基因檢測，篩查了所有研究對象的HSPB1基因及ALS已知致病基因（包括 ALS2、ANG、ANXA11、CHMP2B、DAO、DCTN1、ERBB4、FIG4、FUS、HNRNPA1、MATR3、 NEFH、 NEK1、 OPTN、 PFN1、 SETX、SIGMAR1、SOD1、SPG11、SQSTM1、TARDBP、TBK1、TUBA4A、UBLQN2、VAPB、VCP）外顯子區(qū)（北京康旭醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，Illumina測序），比對到人類參考基因組（hg19版），轉(zhuǎn)錄本NM_001540，并從全局及區(qū)間比對深度，區(qū)間覆蓋情況，位點(diǎn)比對質(zhì)量等多種指標(biāo)對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，并對需要驗(yàn)證的位點(diǎn)進(jìn)行一代驗(yàn)證。

1.3 致病性罕見變異篩選

分別對千人計(jì)劃、國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫及測序得到的ALS患者的HSPB1基因單核苷酸變異（SNV）進(jìn)行過濾，篩選出可能的致病性罕見變異：（1）SNV測序深度＞30×；（2）導(dǎo)致錯(cuò)義突變、無義突變、插入/缺失突變等非同義突變或位于剪切位點(diǎn)；（3）在千人計(jì)劃和國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫中的最小等位基因頻率（MAF）＜1%；（4）通過聯(lián)合注釋相關(guān)缺失突變軟件（CADD），https://cadd.gs.washington.edu，預(yù)測SNV的致病性［16］，篩選出“標(biāo)度”的CADD分?jǐn)?shù)（CADD PHRED）＞20，即在所有基因組有害變異中排在前1%的變異。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS21.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用百分比表示。應(yīng)用R 4.0.2軟件進(jìn)行HSPB1基因罕見變異的序列核關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)（SKAT）及優(yōu)化的序列核關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)（SKAT-O），并對SKAT-O進(jìn)行10000次隨機(jī)重復(fù)取樣驗(yàn)證，以評估HSPB1基因罕見變異在患者及對照間是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSPB1基因罕見變異篩選情況

對166例ALS患者的二代測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控和篩選，共發(fā)現(xiàn)HSPB1基因3個(gè)SNV，均為錯(cuò)義突變，在1000 Genome及國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫中均未發(fā)現(xiàn)，確定為可能的致病性罕見變異（表1）。

表1 ALS患者HSPB1基因可能的致病性罕見變異匯總Tab.1 Potential pathogenic rare HSPB1 variants detected in ALS patients

2.2 罕見變異關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)

分別以千人計(jì)劃和國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫作為對照進(jìn)行了SKAT、SKAT-O及SKAT-O隨機(jī)重復(fù)取樣驗(yàn)證，結(jié)果顯示，兩組間HSPB1基因罕見變異分布差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表2 HSPB1基因罕見變異關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)Tab.2 Association test on rare variants in HSPB1

2.3 HSPB1基因罕見變異攜帶者臨床表型特點(diǎn)

共篩選出的3個(gè)HSPB1基因可能的致病性罕見變異由3名散發(fā)性ALS患者攜帶，均為雜合突變，其中1名患者攜帶兩種SNV，這些患者未發(fā)現(xiàn)其他ALS已知致病基因變異?；颊?為男性，攜帶c.379C＞TSNV，36歲發(fā)病，以下肢無力起病，逐漸進(jìn)展，癥狀局限在下肢超過8年，后逐漸出現(xiàn)左上肢無力，我院就診時(shí)病程已10年，查體示頸段及腰段上、下運(yùn)動(dòng)單位損害表現(xiàn)，肌電圖示頸、胸及腰三段神經(jīng)源性損害表現(xiàn)，診斷為擬診的ALS。患者2為女性，攜帶c.446A＞C，62歲發(fā)病，以下肢無力起病，逐漸加重，發(fā)病1年半出現(xiàn)上肢力弱、言語不清，我院就診時(shí)病程21月，查體示球、頸、腰三段上運(yùn)動(dòng)單位及頸、腰段下運(yùn)動(dòng)單位損害表現(xiàn)，合并面具臉、下肢鉛管樣肌張力增高等可疑錐體外系損害體征，肌電圖示頸、腰段神經(jīng)源性損害表現(xiàn)，診斷為擬診的ALS。患者3為男性，攜帶c.446A＞C及c.451A＞C兩個(gè)SNV，34歲發(fā)病，以言語不清起病，發(fā)病半年出現(xiàn)頸肌無力、呼吸困難，3年半出現(xiàn)四肢近端力弱，我院就診時(shí)病程53月，查體示頸、胸、腰三段上運(yùn)動(dòng)單位損害表現(xiàn)，四段上運(yùn)動(dòng)單位損害表現(xiàn)，肌電圖示四段神經(jīng)源性損害表現(xiàn)，診斷為確診的ALS。3名患者均無認(rèn)知功能損害表現(xiàn)（表3）。

表3 HSPB1基因罕見變異攜帶者臨床表型Tab.3 Clinical characteristics of HSPB1 variant carriers

3 討論

HSPB1基因位于7號染色體，總長度為1739 bp，包含3個(gè)外顯子，編碼小分子量熱休克蛋白（sHSP）家族的重要成員HSPB1，因其相對分子質(zhì)量為27 000，也被稱為熱休克蛋白27（HSP27）。sHSP屬于分子伴侶蛋白，其典型功能是維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，該家族由10個(gè)成員組成（HSPB1-10），它們具有共同的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（ACD），該結(jié)構(gòu)域高度保守［7］，參與二聚體的形成和穩(wěn)定，是后續(xù)形成寡聚復(fù)合物與目標(biāo)蛋白底物結(jié)合的基礎(chǔ)［17］。HSPB1普遍表達(dá)于多種組織細(xì)胞中，能夠減少錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集［6］，對維持細(xì)胞蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，參與細(xì)胞自噬、凋亡、氧化還原平衡以及細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)等多種功能［7,18］。HSPB1基因突變可導(dǎo)致常染色體遺傳的軸索性神經(jīng)?。?-9］，遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳，少量病例為常染色體隱性遺傳，迄今已發(fā)現(xiàn)超過30種該基因與CMT2F及dHMN相關(guān)的致病突變，多位于ACD結(jié)構(gòu)域［9］。近期的基礎(chǔ)研究顯示HSPB1對維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的健康和穩(wěn)定起著重要作用［12］，可通過與SQSTM1結(jié)合影響自噬通路功能［6］。HSPB1在ALS動(dòng)物模型及患者的脊髓組織中均表達(dá)上調(diào)［10,13］，散發(fā)性ALS患者攜帶的HSPB1基因突變導(dǎo)致其喪失分子伴侶功能［14］，推測HSPB1可能與ALS發(fā)病相關(guān)，但也有研究顯示ALS患者脊髓腹角的HSPB1表達(dá)減少［19］。目前HSPB1基因與ALS發(fā)病是否存在關(guān)聯(lián)仍不明確。

近期的大型全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示ALS可能為寡基因罕見變異致病［1,5］。SKAT是一種用于罕見變異與性狀關(guān)聯(lián)性分析的檢驗(yàn)方法，可用于檢驗(yàn)一個(gè)基因中多個(gè)罕見變異的聯(lián)合效應(yīng)，SKAT-O是考慮到變異間相關(guān)性后對SKAT的優(yōu)化算法［20］。已有多項(xiàng)應(yīng)用SKAT分析罕見變異與疾病關(guān)聯(lián)性的研究［21-23］，但該法應(yīng)用于ALS的研究較少，國內(nèi)未見報(bào)道。為明確HSPB1基因與ALS發(fā)病的相關(guān)性，我們應(yīng)用SKAT對ALS患者HSPB1基因可能的致病性罕見變異與不同種族背景的對照進(jìn)行了關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)。本研究共納入166例ALS患者，其男女比例、發(fā)病部位情況與以往中國ALS流行病學(xué)數(shù)據(jù)無明顯差異，但平均發(fā)病年齡較輕［24-25］，更利于研究遺傳因素對ALS的作用。本研究共篩選出HSPB1基因的3個(gè)可能的致病性罕見變異，分別與千人計(jì)劃和國內(nèi)全外顯子測序健康對照數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)，結(jié)果提示HSPB1基因罕見變異與ALS發(fā)病存在相關(guān)性。

攜帶HSPB1致病突變的患者通常表現(xiàn)為進(jìn)行性下肢無力，以雙足下垂為首發(fā)癥狀，發(fā)病年齡通常在30歲左右，患者也可能出現(xiàn)輕微的感覺受累［7-8,26-28］。既往文獻(xiàn)報(bào)告3例ALS患者攜帶HSPB1基因突變［9,14］，患者均于50歲后發(fā)病，無ALS家族史，均有球部受累，查體存在上運(yùn)動(dòng)單位損害體征。1例患者攜帶c.570G＞C突變，58歲發(fā)病，球部起病，合并認(rèn)知功能損害，于發(fā)病2年死亡［14］；1例患者攜帶c.610dupG突變，73歲發(fā)病，合并錐體外系損害，77歲出現(xiàn)球部受累，病程超過9年尚存活［12］；1例患者攜帶c.80G＞T突變，58歲發(fā)病，上肢及球部起病，病程進(jìn)展迅速，于發(fā)病18月死亡［9］。本研究共篩選出HSPB1基因的3個(gè)可能的致病性罕見變異，c.379C＞T、c.446A＞C及c.451A＞C，均位于ACD結(jié)構(gòu)域，其中c.379C＞T為dHMN已知致病突變［8-9］；c.451A＞C與既往dHMN已知致病突變c.452C＞T（p.T151I）影響同一氨基酸［8-9］，Mutation Taster預(yù)測為致病性變異、SIFT預(yù)測為耐受、PolyPhen2預(yù)測為可能致病；c.446A＞C致病性既往未見報(bào)道，Mutation Taster預(yù)測為致病性變異、SIFT預(yù)測為有害、PolyPhen2預(yù)測為可能致病。3名攜帶HSPB1基因致病性罕見變異的ALS患者，均為散發(fā)性病例，無認(rèn)知功能損害表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)共同的臨床表型特點(diǎn)?；颊?攜帶已知致病突變，下肢起病，病程較長?；颊?合并可疑錐體外系損害體征，與既往攜帶c.610dupG突變患者一致［12］，但發(fā)病更早，病情進(jìn)展更快?；颊?攜帶c.446A＞C及c.451A＞C兩個(gè)位置接近的SNV，發(fā)病年齡早，球部起病，就診時(shí)病程較長，為確診的ALS。

本研究應(yīng)用SKAT對HSPB1基因罕見變異與ALS的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了檢驗(yàn)，結(jié)果顯示該基因可能與ALS發(fā)病存在相關(guān)性，為國內(nèi)外首次報(bào)道，但研究樣本量相對較小，考慮可能存在選擇偏倚，可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量以驗(yàn)證研究結(jié)果。對攜帶HSPB1基因致病性罕見變異的ALS患者進(jìn)行臨床表型分析，未發(fā)現(xiàn)特征性臨床表型特點(diǎn)，尚需對篩選出的SNV進(jìn)行功能驗(yàn)證及患者隨訪，以進(jìn)一步明確該基因與ALS發(fā)病及患者臨床表型的關(guān)系。