周麗婷，葉 穎，原海波，吳超逸，吳淑燕

1蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院病原生物學系，江蘇 蘇州 215123；2蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心，江蘇 蘇州 215123

巨噬細胞是機體組織微環(huán)境中重要的免疫細胞，具有吞噬、抗原加工與遞呈、免疫調(diào)節(jié)等生理功能，在自身免疫性疾病、感染、炎癥和腫瘤等疾病中具有關鍵作用［1-3］。巨噬細胞表面模式識別受體可識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式等，從而引起細胞內(nèi)一系列信號級聯(lián)瀑布，介導免疫反應，維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)［4-5］。因此，巨噬細胞作為工具細胞在生命科學研究領域具有重要的應用價值。

沙門菌作為兼性胞內(nèi)菌，經(jīng)腸上皮細胞進入固有層繁殖擴散引發(fā)疾病。機體固有免疫是對抗入侵病原微生物的第一道防線，其中巨噬細胞可通過被動或主動吞噬的方式捕獲沙門菌［6］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞可通過凋亡、自噬和焦亡等多種程序性細胞死亡方式，暴露細菌使其被中性粒細胞等其他免疫細胞“二次清除”［7-8］。細胞焦亡是一種程序性炎性細胞死亡方式，與Gasdermin家族蛋白密切相關，近年來在抗感染免疫應答研究領域備受關注，其中gasdermin D（GSDMD）是細胞焦亡的執(zhí)行蛋白［9-10］。目前關于GSDMD參與抗感染免疫調(diào)控細胞生死命運的具體機制尚未完全明了，所以構建敲除gsdmd基因的細胞或動物模型，為進一步研究GSDMD的作用機制奠定基礎。然而目前為止暫未有成熟的抑制劑用于GSDMD功能的研究，RNA干擾技術的瞬時性和不徹底性為后續(xù)基因功能的分析帶來一定弊端［11］。

基因編輯技術的應用對于利用工具細胞解析特定基因的功能至關重要。盡管CRISPR/Cas9基因編輯技術在多種細胞及動物模型中廣泛應用，然而作為具有吞噬功能的免疫細胞，巨噬細胞因識別外源核酸并啟動免疫應答導致自身極化或死亡而難以轉(zhuǎn)染，外源性質(zhì)粒越大轉(zhuǎn)染難度越大［12-14］。其中小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7常用于炎癥相關研究，因其缺失與細胞死亡相關的凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）而備受關注［15］。國內(nèi)外學者多用病毒介導法進行巨噬細胞RAW 264.7的基因編輯，但由于該方法可能產(chǎn)生具有復制能力的病毒和載體動員帶來的生物安全問題，需要探索新的基因修飾方法［16-17］。此外，病毒介導法攜帶基因不能太大（＜8000b），而電穿孔法可轉(zhuǎn)染較大的基因組（＞65 000 b，Cas9質(zhì)粒約9500 b）。為使巨噬細胞的基因編輯更安全高效，本研究采用將Cas9質(zhì)粒與sgRNA分兩步電轉(zhuǎn)的方法，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建gsdmd-/-RAW264.7細胞，為深入探究GSDMD的功能及其介導的巨噬細胞死亡的機制提供工具和手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞株和質(zhì)粒 鼠傷寒沙門菌標準株野生型SL1344由南京農(nóng)業(yè)大學楊倩教授惠贈，本實驗室利用λRed重組系統(tǒng)自行構建spvC敲除株STM-ΔspvC，利用原核表達載體pBAD/gⅢA構建spvC全序列回補株STM-c-spvC，相關質(zhì)粒由普渡大學周道國教授惠贈。RAW264.7細胞由蘇州大學王國卿教授惠贈。pUC57、pGL3和Cas9質(zhì)粒由蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心張文勝教授惠贈。

1.1.2 主要試劑 T4DNALigase，DL5000 DNAladderr，Proteinase K（TaKaRa）；BsmBⅠ限制性內(nèi)切酶（NEB）；DH5α化學感受態(tài)細胞、2×Rapid Taq Master Mix（Vazyme）；質(zhì)粒小提試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒（天根生化）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、嘌呤霉素、RIPA細胞裂解液、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天）；Opti-MEM 培 養(yǎng) 基（HyClone）；Anti-GSDMD antibody（abcam）；EvaGreen 2×qPCR MasterMix、5×All-In-One RTMasterMix（愛必夢生物）。

1.1.3 主要儀器 酶標儀（Biotek）；電轉(zhuǎn)儀（Lonza）；PowerPac Basic電泳儀（Bio-Rad）；PCR擴增儀（朗基科學）；核酸電泳電泳系統(tǒng)（天能科技）；紫外儀（北京六一）；Viia7熒光定量PCR儀（日立）。

1.2 方法

1.2.1 RAW 264.7-Cas9細胞的構建及鑒定 將2×106RAW264.7細胞用100 μL預熱Opti-MEM重懸，與2μg帶有G418抗性基因（neomycin-resistant）的Cas9質(zhì)粒［18］混均。用電轉(zhuǎn)儀中預存的條件進行電轉(zhuǎn)。常規(guī)培養(yǎng)48h后換含500 ng/mLG418的完全培養(yǎng)基藥篩。無大片細胞死亡后換含250 ng/mL G418完全培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。Trizol法提取細胞總RNA后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物（Cas9-F：AAAGCTCAAAGGGTCTCCCG；Cas9-R：TTATCGAGGTTAGCGTCGGC），qPCR檢測cas9基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，將穩(wěn)定表達cas9基因的RAW 264.7細胞命名為RAW264.7-Cas9。

1.2.2 sgRNA序列設計 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站，搜索gsdmd基因（ID：69146）信息。利用Zhang lab實驗室網(wǎng)站（https://zlab.bio/guidedesign-resources），針對gsdmd基因3號外顯子分別在其外側設計4條sgRNA（圖1A），選擇兩對評分綜合較高的sgRNA，5'端分別加上BsmBⅠ酶切位點的黏性末端（ACCG/AAAC），下劃線處為BsmBⅠ酶切位點，3'端加上sgRNA scaffold同源臂，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成序列（表1）。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Tab.1 Oligonucleotide sequence of sgRNA

1.2.3 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒的構建 以pGL3-sgRNA1-sgRNA3為例構建pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒。以pUC57質(zhì)粒為模板，分別將sgRNA1和sgRNA3作為引物，PCR擴增含U6啟動子的DNA片段，即片段sgRNA1-U6-sgRNA3。經(jīng)脂糖凝膠電泳檢測后回收產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶BsmBⅠ酶切PCR擴增產(chǎn)物和pGL3質(zhì)粒，連接構成串聯(lián)載體pGL3-sgRNA1-sgRNA3。挑取陽性克隆，利用引物（sgRNA-seq-F：CGATTAGTGAACGGATCTCGACG，sgRNA-seq-R：CTGCCATTTGTCTCGAGGTCGAG）進行PCR鑒定（圖1）。根據(jù)電泳結果將PCR反應液送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定（引物為sgRNA-seq-F）。pGL3-sgRNA2-sgRNA4重組質(zhì)粒的構建和鑒定與上相同。

圖1 靶向gsdmd基因3號外顯子突變位點的sgRNA設計Fig.1 Design of sgRNA targeting the third exon of gsdmd mutation site.A:Strategy for knocking out the third exon of gsdmd gene.B:Diagram of pGL3-sgRNA recombinant plasmid targeting the third exon of gsdmdgene.

1.2.4gsdmd-/-RAW 264.7細胞的構建及鑒定 將2μg pGL3-sgRNA1-sgRNA3和pGL3-sgRNA2-sgRNA4重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入RAW 264.7-Cas9細胞中，電轉(zhuǎn)條件同1.2.1，細胞在含2 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中生長至無大片細胞死亡后，換含1μg/mL嘌呤霉素擴大培養(yǎng)。如圖1B所示在sgRNA外側設計一對引物（genotyping-F：ATGCCATCGGCCTTTGAGAA，genotyping-R：GG TAATGGCCAATCCAGCCT），提取基因組DNA進行PCR鑒定后送蘇州金唯智生物科技有限公司測序鑒定（引物為genotyping-F）。

1.2.5 GSDMD蛋白水平鑒定 根據(jù)基因型鑒定結果，提取細胞總蛋白。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，100℃煮沸5 min。取30μg樣品經(jīng)濃度為12%的分離膠進行SDS-PAGE電泳。置于搖床室溫封閉1 h。用兔抗GAPDH，GSDMD抗體（1∶1000稀釋），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10min。山羊抗兔IgG-HRP（1:3000稀釋）室溫孵育1 h。TBST洗滌后檢測GSDMD蛋白表達水平。

1.2.6gsdmd對RAW 264.7細胞死亡的影響 將鼠傷寒沙門菌野生株SL1344（STM-WT）分別與RAW264.7及gsdmd-/-RAW 264.7細胞以感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI）10∶1共培養(yǎng)。感染1 h后，加入含100μg/mL阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基殺死胞外菌。作用2 h后，換含10 μg/mL阿米卡星的DMEM培養(yǎng)基抑制胞外菌生長。于感染24h后PBS輕輕洗滌，加入195μL Annexin V-FITC結合液將細胞輕輕吹打下來。依次加入5μLAnnexin V-FITC和10μLPI染液，輕輕混勻，室溫避光孵育20min，于流式細胞儀檢測。

將鼠傷寒沙門菌野生株、spvC敲除株及回補株（STM-WT、STM-ΔspvC及STM-c-spvC）分別與RAW 264.7及gsdmd-/-RAW 264.7細胞共培養(yǎng)建立上述感染模型。感染24 h后于室溫下1000 r/min離心5 min，收集細胞培養(yǎng)液上清。同時設置無細胞的培養(yǎng)液孔作為空白對照。按照乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒說明書檢測，各組吸光度減去背景空白對照孔吸光度即為樣品吸光度。

1.2.7 統(tǒng)計學分析應用 Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理 采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析進行3組樣本間平均數(shù)的比較，多因素方差分析進行多組樣本間兩兩比較，P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RAW264.7-Cas9細胞的鑒定

與對照組相比，經(jīng)電轉(zhuǎn)后RAW 264.7細胞可穩(wěn)定表達有功能的cas9基因（圖2）。

圖2 qPCR檢測RAW264.7細胞cas9轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 cas9 transcription level in RAW 264.7 analyzed by real-timePCR(****P＜0.01).

2.2 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒構建

測序結果表明sgRNA1～sgRNA4均已成功插入pGL3，且方向、位置均與預期相符（圖3）。

圖3 pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒鑒定Fig.3 Identification of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.A:Amplification of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.M:DL2501 DNA ladder;1.Negative control;2-3:pGL3-sgRNA1-sgRNA4 recombinant plasmids;4-5:pGL3-sgRNA2-sgRNA4 recombinant plasmids.B:Sequencing results of pGL3-sgRNA recombinant plasmids.

2.3 gsdmd-/-RAW264.7細胞的鑒定

測序結果表明sgRNA打靶區(qū)域gsdmd基因的3號外顯子敲除成功，Western blot結果顯示目標細胞中GSDMD蛋白不表達（圖4）。

圖4 gsdmd-/-RAW264.7細胞的鑒定Fig.4 Identification of gsdmd-/-RAW 264.7 cells.A:Amplification of gsdmd.M:DL5000 DNA ladder;1:Negative control;2:RAW 264.7 cells;3:gsdmd-/-RAW 264.7 cells.B:Comparison of gsdmd knockout with original gene sequence.C:GSDMD expression in RAW 264.7 cells detected by Western blot.

2.4 檢測GSDMD對RAW264.7細胞死亡的影響

AnnexinV-FITC/PI染色結果表明gsdmd基因敲除后細胞死亡率顯著降低（圖5A），與流式細胞儀檢測結果一致，gsdmd-/-RAW 264.7各感染組LDH釋放水平顯著低于野生型RAW 264.7細胞感染組。野生型RAW 264.7細胞中spvC敲除株感染組LDH釋放水平顯著高于野生株和回補株感染組（P＜0.01，圖5B）。

圖5 gsdmd基因敲除對RAW264.7細胞死亡的影響Fig.5 Effect of gsdmd gene knockout on RAW 264.7 cell death.A:Cell death detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining.B:LDH release measured by colorimetry(****P＜0.01).

3 討論

本研究在gsdmd基因內(nèi)含子上設計4條sgRNA，分步電轉(zhuǎn)pGL3-sgRNA重組載體及Cas9質(zhì)粒，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建gsdmd基因敲除的巨噬細胞RAW264.7細胞。PCR及DNA測序結果表明3號外顯子成功敲除，Western blot結果證明該細胞株中GSDMD蛋白表達完全缺失。

由于RAW 264.7細胞缺失與細胞死亡相關的ASC，因此較能耐受外源性dsDNA電穿引起的細胞毒性［19］。實驗室前期將pGL3-sgRNA載體與Cas9質(zhì)粒同時電轉(zhuǎn)導入RAW264.7細胞，多次實驗均未成功。外源性質(zhì)粒越大轉(zhuǎn)染難度越大。在人外周血單核細胞（PBMCs）中，外源質(zhì)?！?200 b時，轉(zhuǎn)染效率低于1.5%，細胞凋亡率高于88%［14,20］。此外，隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒數(shù)量的增加，CRISPR/Cas9基因編輯的效率顯著下降［21］。本研究采用分步轉(zhuǎn)染法，將較大的約9500 b的Cas9質(zhì)粒先電轉(zhuǎn)導入RAW 264.7細胞，成功獲得RAW 264.7-Cas9細胞系，隨后轉(zhuǎn)染兩個較小的約6000 b的pGL3-sgRNA重組質(zhì)粒。一方面通過減少外源基因數(shù)量提高轉(zhuǎn)染效率，另一方面構建成功的RAW 264.7-Cas9可作為工具細胞進行其他基因的編輯，為后續(xù)巨噬細胞的基因編輯奠定基礎。因此，先轉(zhuǎn)染Cas9質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)染sgRNA重組質(zhì)粒有望進一步提高CRISPR/Cas9介導的基因編輯的效率。

sgRNA的設計與選擇是CRISPR/Cas9技術的精髓，也是實驗是否成功的關鍵一步，它決定了Cas9的靶向性和特異性。研究表明，sgRNA的長度及兩條sgRNA間的距離可影響打靶效率［22］。不同sgRNA的切點之間的距離越近，效率越高，前期研究常在外顯子內(nèi)部設計sgRNA進行打靶［23］，然而打靶后僅產(chǎn)生幾個堿基的缺口，無法通過PCR快速初篩，1～2天后方可獲得結果。Surveyor nuclease assay利用突變的DNA序列與未突變的DNA序列進行雜交，形成異源雙鏈后，特異性核酸內(nèi)切酶surveyor可檢測其點突變，雖特異性高但相比于直接PCR擴增耗時長且成本高［24］。本研究在外顯子的外側設計sgRNA，將整個外顯子切除致使上千個堿基丟失，用PCR擴增快速初篩，3 h左右即可獲得結果，在難以轉(zhuǎn)染的巨噬細胞中大大提高了篩查效率。此外，雙向sgRNA介導的基因敲除模式可顯著提高敲除效率［25］。研究表明在兔TYR基因上下游分別設計兩條sgRNA，相比于單個sgRNA的突變效率（sgRNA1：82.6%；sgRNA2：39，1%；sgRNA3：52.1%；sgRNA4：43.5%），4條sgRNA共同作用可將敲除效率提高至100%，且未發(fā)生脫靶效應［26］。因此本研究在靶基因上下游分別設計兩條sgRNA，與pGL3載體構建兩個串聯(lián)載體：pGL3-sgRNA1-sgRNA3和pGL3-sgRNA2-sgRNA4。經(jīng)PCR、測序及Western blot鑒定證明gsdmd-/-RAW 264.7細胞構建成功。

鑒于GSDMD在細胞焦亡中的重要作用，利用本研究構建成功gsdmd-/-RAW264.7細胞分析GSDMD對巨噬細胞死亡的影響。流式細胞儀檢測Annexin V-FITC/PI染色，結果表明敲除gsdmd可降低沙門菌感染引起的細胞死亡。將STM-WT，STM-ΔspvC，STM-c-spvC分別與野生型及gsdmd-/-RAW264.7細胞共培養(yǎng)，檢測LDH釋放水平，結果顯示野生型RAW 264.7細胞中spvC敲除株感染組LDH釋放水平顯著高于攜帶有spvC的沙門菌感染組。gsdmd-/-RAW 264.7各感染組LDH釋放水平顯著低于野生型RAW 264.7細胞感染組。文獻報道沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC可抑制腸道早期炎癥反應，促進細菌全身播散［27］。課題組前期發(fā)現(xiàn)該作用與其抑制巨噬細胞焦亡密切相關。本研究利用gsdmd-/-RAW 264.7進一步證實spvC可抑制gsdmd介導的巨噬細胞死亡。GSDMD作為焦亡的關鍵蛋白，介導細胞死亡后還可招募和激活中性粒等免疫細胞發(fā)揮“清道夫”作用［28］。由于伴隨焦亡產(chǎn)生的孔誘導胞內(nèi)陷阱（PITs）可束縛胞內(nèi)菌，而通過焦亡孔道流出的炎癥因子IL-1β和IL-18可募集中性粒細胞發(fā)揮胞葬作用，二次清除PITs和暴露在胞外的細菌，從而防止全身感染［29-30］。因此推測敲除焦亡關鍵基因gsdmd可減少IL-1β和IL-18的分泌，從而抑制中性粒細胞的募集。另有研究表明沙門菌進入中性粒細胞后可引起GSDMD依賴的中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）的釋放，捕獲并殺滅胞外菌［31］。因此GSDMD對吞噬細胞介導的協(xié)同抗菌作用意義重大。

綜上，本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功構建的gsdmd-/-RAW 264.7細胞，并分析gsdmd對沙門菌感染引起的巨噬細胞死亡的影響，為后續(xù)探究GSDMD介導的細胞死亡及其參與的固有免疫反應對細菌播散的影響提供可利用的細胞模型。