徐小惠，李 銳，曾 欣，王 欣，薛炳乾，黃道超，黃 軼

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院兒科研究所//重慶市兒童感染與免疫重點實驗室//兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室//國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心//兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶 400014

慢性肝臟疾病主要包括病毒感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎和自身免疫性疾病等［1］，在全球范圍內(nèi)有著很高的發(fā)病率和死亡率［2］。各種誘因誘發(fā)的慢性肝炎導致慢性肝損傷，可進一步形成肝纖維化，而肝纖維化則是慢性肝炎發(fā)展為肝硬化并最終演變?yōu)楦伟┑谋亟?jīng)階段［3］。因此，探索和研究慢性肝炎引發(fā)肝損傷向肝纖維化發(fā)展的過程，有助于發(fā)掘新型預防或逆轉慢性肝病的藥物與手段。

NDUFA13又名Grim19，是線粒體氧化呼吸鏈（MRC）NADH脫氫酶復合體Ⅰ的亞單位［4］，參與調(diào)控線粒體MRC復合體膜電位、線粒體呼吸氧化磷酸化、細胞凋亡及多種信號轉導等［4-6］。近期研究發(fā)現(xiàn)NDUFA13在肝癌、膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中表達降低或缺失，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，是一種極具潛力的抑癌基因［7-10］。課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中NDUFA13蛋白表達也顯著降低，而其過表達可抑制胃癌細胞的體內(nèi)外增殖與轉移［11］。尤其引起關注的是，慢性萎縮性胃炎（CAG）在“正常-炎癥-萎縮-腸上皮化生”的惡變病理進程中，NDUFA13表達也呈現(xiàn)顯著的漸進性下調(diào)［12］，提示NDUFA13涉及胃癌癌前病變的炎癥惡性進展［12］。

雖然已有研究證實，肝癌組織中NDUFA13蛋白表達明顯缺失［7］，但其是否涉及肝癌前期的炎癥病理甚至惡性進展過程，仍不清楚。因此本研究旨在探索NDUFA13缺失在慢性肝炎病理進程中的作用，為肝癌發(fā)生的早期預防與干預提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 實驗動物 NDUFA13條件敲除小鼠NDUFA13fl/fl（C57BL/6小鼠背景）由賽業(yè)生物科技有限公司采用胚胎干細胞（ES細胞）打靶技術商業(yè)化制備［13］。C57BL/6小鼠購買于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心。Alb-Cre轉基因小鼠[B6.Cg-Tg（Alb-cre）21Mgn/J]購買于上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司。實驗小鼠均飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院實驗動物中心。所有小鼠均在SPF級環(huán)境下（12 h/12 h光照/黑暗條件）飼養(yǎng)，自由采食、飲水，所有實驗操作均符合實驗動物倫理學要求（GDY1801016）。

1.1.2 主要試劑 蛋白酶k（Roche）；Grim19小鼠抗人單克隆抗體（Santa cruz），NF-κB p65小鼠抗人單克隆抗體（Santa cruz），p-NF-κB p65兔抗小鼠多克隆抗體（Santa cruz），NLRP3兔抗人多克隆抗體（Bioss），MPO兔抗小鼠多克隆抗體（Boster），CD45大鼠抗小鼠單克隆抗體（Biolegend），F(xiàn)4/80大鼠抗小鼠單克隆抗體（Biolegend），IL-33兔抗小鼠多克隆抗體（Bioss），IL-1β兔抗人多克隆抗體（Bioss），即用型免疫組化（兔）試劑盒（福建邁新），即用型免疫組化（小鼠）試劑盒（福建邁新），大鼠二步法試劑盒（中杉金橋），山羊抗兔Alexa-Fluor 555熒光二抗（Bioss），山羊抗小鼠Alexa-Fluor 647熒光二抗（Bioss），Dihydroethidium（DHE）染液（AAT），MitoSOX線粒體超氧化物紅色熒光探針（上海翊圣），其余化學試劑均購置于Sigma公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠電泳儀（Bio-Rad），A1R激光共聚焦顯微鏡（Nikon），Mastercycler?X50s PCR擴增儀（Eppendorf）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因敲除鼠的鑒定 將NDUFA13fl/fl小鼠與Alb-Cre轉基因小鼠合籠，獲得肝臟特異性敲除NDUFA13fl/-；Alb-Cre小鼠（圖1A）；于小鼠出生后約21 d，提取鼠尾DNA進行小鼠PCR基因分析鑒定。并分別在4周齡、2年齡處死小鼠時，留取鼠尾及少量肝組織進行PCR基因鑒定。取小鼠3～5mm鼠尾、肝臟組織，分別加入200mL裂解緩沖液及4 μL蛋白酶k，于55℃恒溫消化過夜，離心取100 μL上清與等體積異丙醇混勻，渦旋振蕩棄上清，70%乙醇漂洗、沉淀，離心后棄上清，室溫晾干，加入100 mLddH2O溶解得到DNA溶液，用于PCR反應及瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR引物由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司合成如下：

1.2.2 HE與免疫組化染色 小鼠肝組織經(jīng)4%PFA固定，脫水石蠟包埋制成4μm石蠟切片?？酒蠼?jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟水化，后續(xù)進行蘇木素染細胞核、伊紅染細胞漿，乙醇脫水及二甲苯透明，最后中性樹膠封片；用于免疫組化的石蠟切片，采用0.01 mol/LpH6.0枸櫞酸鈉緩沖液進行微波抗原熱修復，3% H2O2溶液孵育阻斷內(nèi)源性酶，PBS洗滌后加5% BSA室溫封閉，滴加稀釋好的一抗溶液（Grim19 1∶100，NLRP3 1∶500，NF-κB p65 1∶50，p-NF-κB p65 1∶100，MPO 1∶400，CD45 1∶200，F(xiàn)4/80 1∶400）4℃孵育過夜。PBS洗滌后，孵育山羊二抗，然后采用DAB試劑盒顯色，并復染蘇木素，最后利用中性樹脂封片，鏡下觀察。每只小鼠選取2～3個高倍視野（×400），進行免疫組化評分分析，其中免疫細胞統(tǒng)計陽性細胞的數(shù)目，其它指標評分結合陽性百分比與著色強度進行評分［14-15］，結果應用GraphPad Prism 6.0 軟件統(tǒng)計分析。

1.2.3 肝細胞ROS檢測 新鮮小鼠肝組織切成8 μm冰凍切片，加10 mmol/LDHE染液覆于組織上，37℃避光孵育30 min；加5 mmol/L MitoSOX染液覆于組織上，37℃避光孵育15 min。DAPI染液常溫避光復染細胞核20 min，采用抗熒光淬滅劑封片后，用于激光共聚焦顯微鏡采圖，DHE染料激發(fā)波長518 nm，氧化型MitoSOX探針激發(fā)波長510nm。

1.2.4 免疫熒光染色 4%PFA固定的小鼠肝組織，脫水石蠟包埋后制成4 μm石蠟切片，脫蠟水化，經(jīng)枸櫞酸鈉緩沖液進行抗原修復，5%BSA室溫下封閉后，滴加一抗溶液（Grim-19 1∶100，IL-33 1∶400，IL-1β 1∶200）4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后，避光條件下滴加相應的熒光二抗溶液（1∶200稀釋），室溫下孵育60 min，洗滌后加DAPI染色液常溫避光孵育20 min，最后采用抗熒光淬滅封片劑進行封片，激光共聚焦成像采圖。每只小鼠選取2～3個高倍視野（×400），進行平均熒光強度分析，結果應用GraphPad Prism6.0軟件統(tǒng)計分析［15］。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間差異行配對t檢驗或單因素方差分析，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NDUFA13fl/-小鼠的鑒定

采用PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳鑒定合籠小鼠的基因型，鼠尾、肝臟的鑒定結果顯示（圖1B）：WT小鼠Alb-Cre擴增條帶僅野生型351 bp，NDUFA13擴增條帶僅302 bp；NDUFA13fl/-Alb-Cre小鼠Alb-Cre擴增同時有351 bp和150 bp兩條帶，NDUFA13擴增同時有302 bp和382 bp兩條帶。NDUFA13fl/-Alb-cre小鼠的肝臟表達cre重組酶，從而識別LoxP位點，使得NDUFA13基因3號外顯子被敲除。利用免疫組化分別檢測4周齡、2年齡小鼠肝臟組織中NDUFA13蛋白，結果發(fā)現(xiàn)NDUFA13fl/-Alb-cre小鼠肝臟NDUFA13蛋白表達水平均明顯低于對照小鼠（P＜0.001，圖2A、B）。

圖1 NDUFA13fl/-Alb-Cre小鼠構建及子代基因鑒定Fig.1 Construction and genetic identification of NDUFA13fl/-Alb-Cre mice.A:Route of NDUFA13fl/-Alb-Cre mice construction.B:Identification of mouse tail and liver genotypes by PCR(G for Grim19 gene and A for Alb-Cregene).

2.2 NDUFA13失活對肝組織損傷的影響

小鼠肝組織石蠟切片用于HE染色觀察（圖3），4周齡對照小鼠肝小葉結構清楚，肝索排列整齊，匯管及肝竇清晰可見，細胞形態(tài)及大小正常；4周齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織可見肝小葉結構不清，肝竇擴張，肝細胞胞核皺縮，發(fā)生變形、壞死，并伴有炎癥細胞的浸潤；2年齡對照小鼠肝小葉結構完整，部分肝細胞發(fā)生水樣變性，而同組NDUFA13fl/-小鼠肝小葉結構紊亂，大部分肝細胞水腫呈水樣變性，且可見淡粉色纖維組織大量增生，肝細胞輕度脂肪變。

圖2 NDUFA13fl/-Alb-Cre小鼠肝組織NDUFA13蛋白表達檢測Fig.2 Expression of NDUFA13 in NDUFA13fl/-Alb-Cre mice.A:NDUFA13 expression levels in the liver tissues of control and NDUFA13fl/-mice detected by immunohistochemical staining(Original magnification:×400).B:Statistical analysis of NDUFA13 expression in control and NDUFA13fl/-mice.***P＜0.001vscontrol.

圖3 HE染色檢測4周齡、2年齡對照與NDUFA13fl/-鼠肝組織病理情況Fig.3 Pathological changes in the liver tissues of 4-week-old and 2-year-old control and NDUFA13fl/- mice analyzed by HE staining(×400).

2.3 NDUFA13失活對NF-κB信號及炎癥小體的影響

2.3.1 NDUFA13失活激活NF-κB信號分子 小鼠肝組織石蠟切片用于抗p65、抗p-p65檢測NF-κB信號的激活情況，結果顯示，4周齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織p65及p-p65表達相較對照小鼠顯著增強（P＜0.001，圖4A、B）；2年齡對照鼠相較4周齡對照鼠，其肝臟細胞p65及p-p65表達有一定程度增加，而2年齡NDUFA13fl/-鼠胞漿中p-65、胞核內(nèi)p-p65的表達水平顯著高于同年齡對照鼠（P＜0.001，圖4A、B）。

圖4 NDUFA13失活誘導NF-κB信號通路激活Fig.4 NDUFA13 deficiency induces activation of NF-κB signaling pathway(×400).A:P65 expression in 4-week-old and 2-year-old control and NDUFA13fl/-mice detected by immunohistochemical staining.B:p-P65 expression in 4-week-old and 2-year-old control andNDUFA13fl/- mice detected by immunohistochemical staining.***P＜0.001vscontrol.

2.3.2 NDUFA13失活促進NLRP3炎癥小體的生成 抗NLRP3-CIAS1免疫組化染色檢測結果顯示，相比對照小鼠，4周齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織中有明顯、散在的炎癥小體聚集；而2年齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織中大部分肝細胞有炎癥小體的產(chǎn)生與聚集，且顯著強于對照組小鼠（P＜0.001，圖5A、B）。

圖5 NDUFA13失活誘導炎癥小體產(chǎn)生Fig.5 NDUFA13 inactivation induces inflammasome production.A:NLRP3 detection of 4-week-old and 2-year-old control and NDUFA13fl/-mice(×400).B:Statistical analysis of NLRP3 production in control and NDUFA13fl/-mice.***P＜0.001vscontrol.

2.4 NDUFA13失活對肝臟細胞ROS產(chǎn)生的影響

利用DHE和MitoSOX染色試劑盒分別檢測2年齡鼠肝細胞ROS、線粒體ROS的產(chǎn)生情況。圖6結果顯示，2年齡鼠的肝細胞總ROS、線粒體ROS水平均顯著高于對照組小鼠。

圖6 NDUFA13失活后細胞ROS水平檢測Fig.6 Changes in ROS level resulting from NDUFA13 loss(×200).A:Total ROS levels in 2-year-old control and NDUFA13fl/-mice examined by DHE staining.B:Mitochondrial ROS levels in 2-year-old control and NDUFA13fl/-mice examined by Mitosox staining.

2.5 NDUFA13失活誘導肝臟自發(fā)性炎癥

2.5.1 免疫組化檢測炎癥細胞的浸潤情況 小鼠肝組織石蠟切片用于抗CD45、MPO、F4/80免疫組化染色檢測，結果顯示，與對照小鼠相比，4周齡、2年齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織中CD45、MPO、F4/80炎癥細胞的浸潤均顯著增加（P＜0.001，圖7）。

2.5.2 免疫熒光檢測炎癥因子的表達情況 小鼠肝組織用于免疫熒光檢測，圖8結果顯示，與對照小鼠相比，2年齡NDUFA13fl/-小鼠肝組織中NDUFA13蛋白表達明顯降低，而IL1-β、IL-33分泌均顯著增高（P＜0.001，圖8）。

3 討論

NDUFA13作為線粒體呼吸鏈復合體的關鍵組分蛋白，主要表達定位在線粒體內(nèi)膜，對呼吸鏈的電子傳遞活性起重要作用。近年來諸多研究證實了NDUFA13蛋白在多種惡性腫瘤中表達紊亂的特點［7-10］，而其在惡性病理前的慢性炎癥階段所發(fā)揮的作用尚未見報道。已有研究表明NDUFA13基因皮膚組織雜合敲除可促進小鼠鱗狀癌的成瘤［13］，我們的實驗首次利用NDUFA13基因肝臟特異性敲除小鼠，對NDUFA13蛋白失活在誘導小鼠慢性肝炎中的作用與機制進行探討，發(fā)現(xiàn)NDUFA13部分失活可促進ROS釋放，激活NF-κB及炎癥小體的產(chǎn)生，引起炎癥細胞與炎癥因子聚集，從而誘導小鼠自發(fā)性肝損傷。

線粒體作為細胞能量供應與代謝的中心場所，從多方面調(diào)節(jié)細胞的生長、分裂、衰老及凋亡等生命過程，并直接或間接地參與到腫瘤細胞的代謝調(diào)控，其結構與功能的穩(wěn)定對于細胞適應環(huán)境壓力、抑制腫瘤發(fā)生等至關重要［16］。研究報道了線粒體缺陷會影響多種組織的正常生理功能，相關的疾病往往也是毀滅性的［17］。正如我們實驗結果所見，NDUFA13蛋白完全敲除的小鼠后代幾乎無法存活，而NDUFA13部分敲除的小鼠則能夠存活下來。這表明NDUFA13蛋白作為線粒體的關鍵組分蛋白，其表達缺失會極大地破壞線粒體的結構與功能，因而可能誘導炎癥甚至惡性病變的發(fā)生。

NDUFA13作為一種抑癌基因，其突變或失活可誘導包括JAK/STAT、p53及NF-κB［11,18-19］等多種信號通路的改變，因此參與多種惡性腫瘤細胞增殖、細胞凋亡及細胞侵襲與轉移等過程的調(diào)控［20］。尤其，課題組前期研究證實了NDUFA13通過調(diào)控NF-κB信號進而調(diào)控胃癌的侵襲與轉移［11］。NF-κB信號是目前最典型的慢性炎癥調(diào)控信號通路之一，參與調(diào)控各階段炎癥反應的轉錄激活，促進多種炎癥細胞因子的生成，而這些促炎因子又能反向誘導NF-κB的激活，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)放大作用［21］。此外，NF-κB還可直接結合Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體的啟動子促進其轉錄激活，形成炎癥小體［22］。其中NLRP3屬目前研究最廣泛的一類炎癥小體，是炎癥性疾病中由細胞內(nèi)模式識別受體（PRRs）參與組裝形成的一類多蛋白復合體［23］，受多種信號調(diào)控被激活。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，NDUFA13表達缺失的小鼠NF-κB信號通路持續(xù)激活，且肝臟內(nèi)NLRP3炎癥小體顯著活化，因而促進了各類促炎因子的成熟與分泌，伴隨的慢性炎癥反應則會極大地破壞肝臟微環(huán)境，對肝實質(zhì)造成不可逆的損傷［24］。

活性氧ROS作為線粒體能量代謝中的主要產(chǎn)物，參與機體及細胞的氧化應激調(diào)節(jié)。課題組研究發(fā)現(xiàn)NDUFA13失活通過調(diào)節(jié)ROS氧化應激通路而調(diào)控胃癌的轉移［25］，另有研究報道了NDUFA13蛋白可降低線粒體呼吸鏈復合物I活性并減少ROS的產(chǎn)生［26］。這與我們的實驗發(fā)現(xiàn)相一致，小鼠肝臟NDUFA13失活導致細胞內(nèi)總ROS及線粒體ROS水平均顯著增加。而相關資料表明ROS可直接或間接地調(diào)節(jié)炎癥性小體的產(chǎn)生：一方面，ROS可增加線粒體的通透性引起線粒體DNA釋放至胞漿，線粒體DNA進一步激活NLRP3炎癥小體［27］；另一方面，細胞內(nèi)ROS是激活與調(diào)控NF-κB的重要上游因子［28］，通過NF-κB的激活進一步促進炎癥小體的生成。NF-κB的激活與NLRP3炎癥小體的形成則會誘導炎癥細胞的招募和炎癥因子的產(chǎn)生，最終造成對靶組織或靶器官的免疫炎癥性損傷。

我們的研究結果提示了，NDUFA13缺失促進細胞及線粒體ROS的聚集，ROS直接地激活了NLRP3炎癥小體，或通過引起下游NF-κB p65、p-p65表達增加，間接地促進NLRP3炎癥小體形成，從而募集CD45、MPO、F4/80等炎癥細胞，釋放IL1β、IL33等炎癥因子，導致肝臟慢性免疫性炎癥的形成與發(fā)展。此外，我們也注意到，2年齡對照小鼠的肝組織部分肝竇擴張、肝細胞有水樣變性改變，且其NF-κB信號分子表達有一定程度增加，這可能與小鼠肝衰老的非特異性炎癥反應有關［29］，也可能因此導致了其NDUFA13蛋白的表達量明顯減少，而這有待后續(xù)進一步的探究。

綜上所述，小鼠肝臟NDUFA13失活可以誘導其自發(fā)性肝炎病理進程的發(fā)生與發(fā)展，其可能機制是NDUFA13缺失通過影響ROS的生成而調(diào)控ROS/NLRP3、ROS/NF-κB/NLRP3炎癥通路，引發(fā)慢性炎癥損傷。本研究初步闡明了NDUFA13調(diào)控慢性肝炎病理的作用與機制，對于探討慢性肝臟疾病相關的有效干預手段或藥物靶點具有重要的意義。