方振華，蒙美姑，黨朝暉，洪美玲，丁 利

(1.海南職業(yè)技術(shù)學院 熱帶農(nóng)業(yè)技術(shù)學院，海南 海口 570216； 2.海南師范大學 生命科學學院， 熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南 海口 571158 )

甲、頭肢部潰爛、蛻皮等[4,7,9]，給龜鱉養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。感染摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌后，龜?shù)呐R床癥狀及剖檢病理變化較為相似，如腹甲、皮膚等潰爛，內(nèi)臟出血等，發(fā)病迅速，嚴重時甚至導致龜鱉的大量死亡，有時兩種致病菌呈交叉感染。但兩種菌在臨床治療上有一定的差異，如龜源鮑曼不動桿菌對慶大霉素耐藥，而摩氏摩根菌對慶大霉素敏感等。故兩種菌的鑒別診斷對于臨床治療尤為重要。目前針對疾病的診斷依然采用傳統(tǒng)的檢測方法，但因其方法繁瑣、工作量大、耗時長、敏感度低，遠不能滿足龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)上的迫切需求。龜鱉疾病傳統(tǒng)的診斷方法很難同時快速檢測兩種病原菌，臨床鑒別診斷困難。因此研究靈敏度高、特異性強的PCR快速檢測方法尤為迫切和必要。通過對龜鱉摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌及兩種病原菌混合感染的快速鑒別診斷，可迅速明確病原菌，有針對性地指導用藥，可為龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)中該類疾病的預防和治療提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

龜源鮑曼不動桿菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapeneumoniae)、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)及惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)均為實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

ExTaq酶(5 U/μL)購自Promega公司；組織基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司、DL2000 DNA Marker、dNTP等常規(guī)PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計及合成

鮑曼不動桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因引物序列見表1，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物的核苷酸序列、擴增長度及登錄號

1.4 DNA模板的制備

將凍存的鮑曼不動桿菌和摩氏摩根菌接種于LB 液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后將菌液離心，收集細菌沉淀，按照試劑盒說明書提取細菌DNA。

1.5 單重及雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

應(yīng)用鮑曼不動桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gryB基因的特異性引物進行PCR擴增，應(yīng)用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行回收并進行序列測定。然后對雙重PCR反應(yīng)的退火溫度、引物濃度、MgCl2濃度、dNTP濃度等進行優(yōu)化。按25 μL反應(yīng)體系：引物(10 μmol/L)分別為0.5 μL(0.2 μmol/L)、0.75 μL(0.3 μmol/L)、1 μL(0.4 μmol/L)和1.25 μL(0.5 μmol/L)，退火溫度分別為55.0、55.5、56.4、57.7、59.3、60.6、61.5、62.0 ℃，dNTP(2.5 mmol/L)分別為0.5 μL(0.125 mmol/L)、1.0 μL(0.25 mmol/L)、2.0 μL(0.5 mmol/L)和3.0 μL(0.75 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L)分別為0.5 μL(1.25 mmol/L)、1.0 μL(2.5 mmol/L)、2.0 μL(5 mmol/L)和3.0 μL(7.5 mmol/L)進行反應(yīng)條件的優(yōu)化，每優(yōu)化一項時保持其他條件不變。

1.6 雙重PCR方法特異性試驗

分別用龜源鮑曼不動桿菌、摩氏摩根菌、肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌DNA 作為模板，按1.5中優(yōu)化好的反應(yīng)體系及條件進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳對該雙重PCR方法的特異性進行分析。

1.7 雙重PCR方法敏感性試驗

提取鮑曼不動桿菌、摩氏摩根菌DNA，經(jīng)超微量核酸分光光度計測定濃度。將2種菌的DNA等量混合，然后做10倍倍比稀釋，以不同稀釋倍數(shù)的DNA混合物為模板(2.0 μL)進行PCR擴增，以獲得所建立的雙重PCR方法的敏感性。

1.8 雙重PCR檢測方法的應(yīng)用

采集海南省多家龜鱉養(yǎng)殖場病死龜肝臟等組織樣本，參照試劑盒說明書中的操作步驟進行病料組織DNA的提取，以此為模板進行單重和雙重PCR檢測。

2 結(jié) 果

2.1 單重PCR擴增結(jié)果

利用設(shè)計好的鮑曼不動桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因特異性引物分別進行PCR擴增后，分別獲得約401、917 bp大小的片段，與預期結(jié)果一致(圖1)。經(jīng)序列比對分析顯示，獲得的PCR產(chǎn)物與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中鮑曼不動桿菌rpoB基因及摩氏摩根菌gryB基因序列的同源性均在99%以上。

2.2 雙重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

通過對鮑曼不動桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB基因的引物濃度、退火溫度、dNTP濃度、MgCl2濃度進行優(yōu)化。試驗結(jié)果顯示，上、下游引物各為0.3 μmol/L時具有較好的擴增效果(圖2a)；退火溫度為55～59.3 ℃均能擴增出較清晰的條帶，根據(jù)特異性原則，確定退火溫度為59.3 ℃(圖2b)；dNTP濃度為0.5 mmol/L；MgCl2濃度為5 mmol/L(圖3)。

2.3 特異性試驗

由特異性試驗結(jié)果可知，鮑曼不動桿菌rpoB基因和摩氏摩根菌gyrB出現(xiàn)2條清晰條帶，大小分別約為401、917 bp，而龜源肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌均未擴增出目的片段(圖4a)。

2.4 敏感性試驗

分別對摩氏摩根菌DNA(125.7 ng/μL)和鮑曼不動桿菌的DNA(41.2 ng/μL)進行10倍倍比稀釋作為擴增模板，其中摩氏摩根菌DNA質(zhì)量濃度依次為125.7、12.57、1.257、1.257×10-1、1.257×10-2、1.257×10-3、1.257×10-4ng/μL，鮑曼不動桿菌的DNA質(zhì)量濃度依次為41.2、4.12、4.12×10-1、4.12×10-2、4.12×10-3、4.12×10-4、4.12×10-5ng/μL。模板等體積混合物(各1 μL)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析表明，雙重PCR方法對摩氏摩根菌最低檢測質(zhì)量濃度為1.257×10-3ng/μL，鮑曼不動桿菌最低檢測核酸質(zhì)量質(zhì)量濃度為4.12×10-3ng/μL(圖4b)。

2.5 臨床樣本檢測結(jié)果

對臨床32例疑似病料應(yīng)用雙重PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌感染12例，摩氏摩根菌11例(圖5)，陽性檢出率分別為37.5%和34.4%，混合感染5例，陽性檢出率為15.6%(表2)，與單一PCR的陽性檢出率一致。

圖1 單重PCR擴增結(jié)果Fig.1 The amplification results of single PCR M.DL2000DNA marker; 1.鮑曼不動桿菌rpoB基因; 2.摩氏摩根菌gyrB基因. M.DL2000DNA marker; 1.rpoB gene of A. baumannii; 2. gyrB gene of M. morganii.

圖3 雙重PCR dNTP(a)和MgCl2濃度(b)優(yōu)化結(jié)果Fig.3 The optimization of dNTP (a) and MgCl2 concentration (b) of duplex PCR a: M.DL2000 marker; 1.0.125 mmol/L; 2.0.25 mmol/L; 3.0.5 mmol/L; 4.0.75 mmol/L. b: M.DL2000 marker; 1.7.5 mmol/L; 2.5 mmol/L; 3.2.5 mmol/L; 4.1.25 mmol/L.

圖4 雙重PCR的特異性(a)和敏感性(b)檢測結(jié)果Fig.4 The test results of specificity (a) and sensitivity (b) of duplex PCR a: M.DL2000 DNA marker; 1.鮑曼不動桿菌; 2.摩氏摩根菌; 3.鮑曼不動桿菌和摩氏摩根菌; 4.肺炎克雷伯氏菌; 5.維氏氣單胞菌; 6.惡臭假單胞菌.b: M.DL2000Marker; 1～7.模板DNA依次稀釋100～106倍. a: M.DL2000 DNA marker; 1.A. baumannii; 2.M. morganii; 3.A. baumannii and M. morganii; 4.K. pneumoniae; 5.A. veronii; 6.P. putida.b: M.DL2000Marker; 1—7.template DNA diluted by 100～106 times.

圖5 臨床樣本雙重PCR檢測結(jié)果Fig.5 The test results of clinical samples by duplex PCR M.DL2000 marker; 1～32.臨床樣本. M.DL2000 marker; 1—32.clinical samples.

表2 臨床樣品單重和雙重PCR檢測結(jié)果

3 討 論

龜鱉養(yǎng)殖因所需飼料、用量、人工、用地面積均較少，養(yǎng)殖回報率高，并且龜鱉具有較高的食用、藥用和觀賞價值等，已成為特種水產(chǎn)養(yǎng)殖的熱點和經(jīng)濟增長點。在21世紀初發(fā)展迅猛，多種養(yǎng)殖模式在各省尤其是廣東、廣西、福建和海南得到迅速發(fā)展，形成了面積規(guī)模化、種類多樣化、數(shù)量集約化的產(chǎn)業(yè)化模式[1-2,18]。龜鱉養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展、貢獻日益凸顯的同時，也受到疾病的嚴重困擾和威脅。如鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、摩氏摩根菌等感染龜鱉后，可引起龜鱉發(fā)病，嚴重者可造成其大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大經(jīng)濟損失[4,7,19]。

3.1 摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌在龜鱉養(yǎng)殖業(yè)中的發(fā)病情況

摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌均屬于條件致病菌，在水體、土壤及空氣中廣泛分布，可引起嚴重的感染，導致包括人在內(nèi)的多種動物死亡[14,20]。同時摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌也是嚴重危害我國龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病病原。如摩氏摩根菌感染黃喉擬水龜(Mauremysmutica)可致其死亡[9-10]，摩氏摩根菌可導致中華鱉(Trionyxsinensis)感染頭面部癤瘡及出血性腸道壞死疾病[7-8]；鮑曼不動桿菌感染龜主要引起背腹甲糜爛、潰瘍，內(nèi)臟出血等病癥[4]，感染中華鱉引起穿孔病、腐皮病、溶血性腹水病等癥狀[21]。由目前的多例病理報道不難發(fā)現(xiàn)，龜鱉感染摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌后，臨床癥狀及病理變化較為接近，而且本課題組在多年的研究中也發(fā)現(xiàn)，這兩種菌感染率和發(fā)病率均較高，并時常呈現(xiàn)交叉感染，給臨床鑒別診斷和防治造成了嚴重的困難。尤其是目前龜鱉細菌性疾病多依賴抗生素進行防治，而抗生素的頻繁使用，導致耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使疾病的診治愈來愈困難和復雜[5]。同時龜鱉疾病的研究起步相對較晚，研究基礎(chǔ)較為薄弱，針對病原菌的診斷，多是采用傳統(tǒng)的檢測方法，如病原菌分離、形態(tài)學觀察、理化鑒定等。此類方法工作量大、繁瑣、耗時長，遠不能滿足龜鱉養(yǎng)殖生產(chǎn)的迫切需求，雖然目前也有針對鮑曼不動桿菌和摩氏摩根菌的分子生物學診斷方法[4,10]，但多是針對單一病原菌的PCR檢測。因此研究靈敏度高、特異性強的龜鱉病原菌快速診斷技術(shù)和方法尤為迫切和必要。

3.2 龜源摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌診斷方法的建立

gyrB基因和rpoB基因常分別被應(yīng)用于摩氏摩根菌和不動桿菌屬菌種分類及鑒定[22-23]。故筆者選用此兩種基因設(shè)計引物，均獲得特異性目的條帶，通過對PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，建立了快速鑒別診斷摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌及其混合感染的雙重PCR診斷方法。此外，為檢驗該雙重PCR方法的特異性，本試驗選用了龜鱉養(yǎng)殖中常見的一些病原菌如龜源維氏氣單胞菌、惡臭假單胞菌及肺炎克雷伯氏菌。雖然已有報道嗜水氣單胞菌可引起龜鱉發(fā)病，但近幾年并未在龜鱉養(yǎng)殖場篩查出該菌，故檢驗雙重PCR方法特異性試驗時未選用嗜水氣單胞菌。由特異性結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法對上述致病菌均無擴增，說明該方法的特異性較高。此外，本方法的檢出率與單一PCR方法無差異。

4 結(jié) 論

本試驗所建立的針對兩種病原菌檢測的雙重 PCR方法具有較強的特異性，僅對摩氏摩根菌和鮑曼不動桿菌有擴增，對其他病原菌如肺炎克雷伯氏菌、維氏氣單胞菌及惡臭假單胞菌等無擴增；此方法靈敏度高，對鮑曼不動桿菌和摩氏摩根菌最低檢測質(zhì)量濃度分別為4.12×10-3ng/μL和 1.257×10-3ng/μL，在臨床病料的檢測上與單一PCR檢測結(jié)果一致。該方法可為龜鱉類鮑曼不動桿菌和摩氏摩根菌的鑒別診斷和臨床調(diào)查提供幫助。