劉濱瑋，劉 帥，姜潔明，翁歆之，楊顏溢，伍明鳴，劉文雷，王子維，王連順，劉 奇，秦玉雪

(1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 3.臺(tái)州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，浙江 臺(tái)州 318000 )

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)俗稱梭子蟹、飛蟹，屬甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，為大型經(jīng)濟(jì)蟹類，生理生命可達(dá)2～3年，但3齡者較少，雄性最大的個(gè)體體質(zhì)量可達(dá)710 g；雌性個(gè)體體質(zhì)量可達(dá)730 g[1]。廣泛分布于西北太平洋沿岸海域，包括日本、韓國(guó)、朝鮮、中國(guó)、越南及馬來西亞沿海[2-3]。因肉質(zhì)鮮美，口感細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，1981年開始被列為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的對(duì)象[4-8]。1986—1988年我國(guó)營(yíng)口地區(qū)首次開展人工放流，放流C2期稚蟹共60余萬只[9]。

遼東灣位于渤海東北部，是一個(gè)半封閉的淺海灣，水交換能力較弱，水循環(huán)周期約為15 a[10]。沿岸有遼河、大凌河、六股河等多條河流匯入[11]，帶來了大量營(yíng)養(yǎng)鹽，灣內(nèi)初級(jí)生產(chǎn)力較高，餌料生物充足，具有河口地區(qū)典型的生境特征，曾是包括三疣梭子蟹在內(nèi)多種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的重要索餌場(chǎng)和產(chǎn)卵場(chǎng)[12-13]。三疣梭子蟹屬雜食性底棲動(dòng)物，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著調(diào)節(jié)餌料生物、小型動(dòng)植物密度，以及提高水域資源價(jià)值的關(guān)鍵生態(tài)角色，是開展資源增殖與養(yǎng)護(hù)的適宜種類[14]。伴隨20世紀(jì)90年代遼東灣沿岸經(jīng)濟(jì)崛起[15]，三疣梭子蟹漁業(yè)資源迅速衰退，在2004—2008年，遼東灣盤錦海域難以形成有效的梭子蟹漁汛，故依靠天然群體的自然繁殖來恢復(fù)種群規(guī)模并不現(xiàn)實(shí)[16-17]。為恢復(fù)梭子蟹漁業(yè)資源量，保證漁業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和維持遼東灣生態(tài)系統(tǒng)平衡，自2012年開始，遼東灣海域以每年4—5月間海捕受精的雌性親蟹作為產(chǎn)卵群體，人工孵化出F1代群體，開展規(guī)?；鲋撤帕?。2015年，全省共放流C2期稚蟹1000余萬只。目前，三疣梭子蟹已成為遼寧省第二大規(guī)模人工增殖種類。

近年來，在我國(guó)沿海地區(qū)廣泛開展了三疣梭子蟹放流工作，取得了一定經(jīng)濟(jì)效果。然而截至目前，對(duì)三疣梭子蟹增殖放流缺乏有效監(jiān)控和定量分析。筆者利用6對(duì)高多態(tài)性微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記，對(duì)遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流開展大規(guī)模追蹤調(diào)查，以期評(píng)估放流后短期時(shí)間內(nèi)各月間回捕到的放流蟹占當(dāng)月回捕蟹群體的比例(月間回捕率)以及雌性親蟹對(duì)回捕到的放流子代群體的貢獻(xiàn)率程度(繁殖貢獻(xiàn)率)，為將來建立科學(xué)的放流體系，構(gòu)建負(fù)責(zé)任增殖放流新模式提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 三疣梭子蟹增殖放流

2015年增殖放流承擔(dān)單位使用50只海捕已受精雌蟹作為繁殖親蟹，經(jīng)暫養(yǎng)、人工繁育等步驟，共產(chǎn)生約500萬只C2期稚蟹，2015年6月，將上述稚蟹放流到盤錦沿岸海域。于當(dāng)年7月28日—10月3日在盤錦沿岸以地籠網(wǎng)形式開展回捕調(diào)查，共獲得1671只三疣梭子蟹樣本，剪其螯足，剝離肌肉冷凍運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立刻用無水乙醇多次洗滌后長(zhǎng)期保存。

1.2 放流子代三疣梭子蟹個(gè)體識(shí)別

1.2.1 DNA抽提

采用吸附柱法(TIANamp Marine Animals DNA Kit，中國(guó))從50只雌性繁殖親蟹與1671只回捕蟹的螯足中提取DNA，共計(jì)對(duì)1721只三疣梭子蟹樣本開展個(gè)體識(shí)別。同時(shí)采用含量為1.00%的瓊脂糖凝膠電泳(DYY-8C型，中國(guó))來檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，使用核酸定量分析儀來檢測(cè)DNA濃度(K2800，中國(guó))。

1.2.2 微衛(wèi)星引物

共使用6對(duì)具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記開展試驗(yàn)。在預(yù)試驗(yàn)階段，以上引物可靠性均經(jīng)過野生群體驗(yàn)證。引物序列參考文獻(xiàn)[18-21]的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每對(duì)引物均在5′端添加相應(yīng)的熒光修飾接頭(表1)。

表1 多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的特征

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與毛細(xì)管電泳

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)流程和體系參照文獻(xiàn)[13]，但每個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)總體積設(shè)置為15 μL，為了保證檢測(cè)的可靠性，使用上述6對(duì)引物對(duì)1721只三疣梭子蟹(50只親本，1671只回捕個(gè)體)樣本單獨(dú)擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，使用ABI3730XL基因分析儀(Applied Biosystems，美國(guó))基因測(cè)序儀開展毛細(xì)管電泳，并基于GeneMapper(4.0版本)軟件繪制熒光信號(hào)峰圖，最后進(jìn)行人工校正。在進(jìn)行毛細(xì)管電泳時(shí)，設(shè)置多組陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照，保證所繪制的基因型數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性(圖1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 親子鑒定

首先使用Microchecker 2.2.3軟件[22]檢測(cè)基因型繪制錯(cuò)誤和無效等位基因頻率情況，采用親緣關(guān)系分析軟件Cervus 3.0.7[23]開展親子鑒定及遺傳多樣性分析，所分析的遺傳參數(shù)包括：等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、同時(shí)計(jì)算非親排除率，分子標(biāo)記的累積排除率，根據(jù)鑒定成功的位點(diǎn)數(shù)量計(jì)算鑒定準(zhǔn)確率，最終計(jì)算出親本對(duì)子代的貢獻(xiàn)率。各親本間的繁殖貢獻(xiàn)率差異經(jīng)SPSS 22.0中的非參數(shù)卡方檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為差異顯著。

圖1 微衛(wèi)星位點(diǎn)代表性分型結(jié)果Fig.1 Typical genotype of the microsatellite loci

1.3.2 各月間回捕到的放流蟹占當(dāng)月回捕蟹群體的比例

2015年6月放流后，于7—10月在盤錦沿岸主要采用地籠網(wǎng)調(diào)查的方式開展回捕調(diào)查，調(diào)查地點(diǎn)見圖2。并基于親子鑒定結(jié)果，繪制出盤錦海域放流三疣梭子蟹月間回捕率變化圖，查明各月間回捕到的放流三疣梭子蟹占當(dāng)月回捕蟹群體的比例變化趨勢(shì)。

圖2 盤錦海域回捕調(diào)查范圍Fig.2 Investigation area for recapture swimming crab in coastal Panjin area

1.3.3 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性比較

比較雌性繁殖親蟹(50只)與回捕蟹群體(1671只)的遺傳多樣性差異以探討放流事件中雌性繁殖親蟹的遺傳多樣性層次。使用Arlequin 3.5軟件[24]對(duì)上述2個(gè)群體開展哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)；使用GenAlEx 6.503軟件[25-26]分析等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度和無偏期望雜合度；使用HP Rare 1.0軟件[27]分析等位基因豐度。多重檢驗(yàn)經(jīng)sequential Bonferroni校正顯著性[28]。雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體間的遺傳指標(biāo)差異經(jīng)SPSS 22.0中的配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 微衛(wèi)星擴(kuò)增片段分析

本試驗(yàn)所使用的6對(duì)高多態(tài)性微衛(wèi)星引物在三疣梭子蟹群體中均能獲得穩(wěn)定的、高強(qiáng)度的毛細(xì)管檢測(cè)信號(hào)(圖1)。無效等位基因頻率檢測(cè)顯示，所有位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)明顯的無效等位基因干擾(<0.02)(表2、表3)，證實(shí)這些引物可以用于后續(xù)的遺傳多樣性分析與親子鑒定。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，6對(duì)微衛(wèi)星引物共在2個(gè)群體中獲得519個(gè)等位基因，其中在雌性繁殖親蟹群體成功擴(kuò)增出176個(gè)等位基因；在回捕蟹群體擴(kuò)增出343個(gè)等位基因，此外等位基因出現(xiàn)最多的微衛(wèi)星引物為Pot51，最少的為Ptri1。兩群體中多態(tài)信息含量平均值均大于0.9，也印證了所使用的微衛(wèi)星引物的高多態(tài)性。

表2 三疣梭子蟹雌性繁殖親蟹微衛(wèi)星DNA標(biāo)記特征參數(shù)

表3 三疣梭子蟹回捕群體微衛(wèi)星DNA標(biāo)記特征參數(shù)

2.2 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性分析

雌性繁殖親蟹與回捕蟹兩群體開展了遺傳學(xué)參數(shù)分析，計(jì)算了等位基因、有效等位基因、等位基因豐度、多態(tài)信息含量、期望雜合度、無偏期望雜合度和觀測(cè)雜合度等參數(shù)。以上參數(shù)在雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體中成正態(tài)分布(P>0.05，Shapiro-Wilk test，SPSS)，故使用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性差異發(fā)現(xiàn)，除回捕蟹群體的等位基因(57.167)顯著大于雌性繁殖親蟹群體(29.333)外，其他遺傳學(xué)參數(shù)在兩群體間均無顯著差異(P>0.05，SPSS)，證實(shí)三疣梭子蟹增殖放流所使用的雌性繁殖親蟹遺傳多樣性較高。同時(shí)就整體而言，雌性繁殖親蟹群體盡管樣本數(shù)量遠(yuǎn)不及回捕蟹群體，但基因頻率符合哈迪溫伯格平衡(P>0.05，SPSS)，進(jìn)一步證實(shí)所使用的雌性繁殖親蟹群體種質(zhì)較好(表4)。

表4 雌性繁殖親蟹與回捕群體遺傳參數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.3 親子鑒定分析

因在三疣梭子蟹人工放流過程中，父本基因型未知，故使用Cervus軟件中的母本鑒定開展親子鑒定。親子鑒定結(jié)果顯示，當(dāng)使用4個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記時(shí)，累積排除率為0.9979，親子鑒定的準(zhǔn)確率為84.17%；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為5個(gè)時(shí)，累積排除率為0.9993，親子鑒定的準(zhǔn)確率為90.83%；微衛(wèi)星分子標(biāo)記為6個(gè)時(shí)，累積排除率為0.9997，親子鑒定的準(zhǔn)確率為95.83%(表5，圖3)，最終從回捕群體中共發(fā)現(xiàn)120只放流子代。

表5 親權(quán)鑒定參數(shù)

圖3 不同微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)的親子鑒定準(zhǔn)確率Fig.3 Identification accuracy of different microsatellites for parental authority

2.4 繁殖貢獻(xiàn)率分析

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的樣本中，有22只雌性繁殖親蟹在1671只回捕蟹群體中鑒定到其所產(chǎn)子代，占所檢測(cè)的雌性繁殖親蟹總樣本的44%。但各雌性繁殖親蟹對(duì)子代的繁殖貢獻(xiàn)率存在顯著差異(χ2=142.050，自由度=6，P<0.001，非參數(shù)卡方檢驗(yàn))。在鑒定到的120只回捕子代當(dāng)中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻(xiàn)率為51.67%，親蟹2貢獻(xiàn)率為15.00%，親蟹3貢獻(xiàn)率為5.83%，其他親蟹對(duì)子代的貢獻(xiàn)率僅維持在0.83%～4.17%(圖4)。

2.5 盤錦海域放流三疣梭子蟹月間回捕分析

本次三疣梭子蟹回捕調(diào)查歷時(shí)4個(gè)月，其中7月共回捕到359只，基于分子標(biāo)記，從回捕蟹群體中識(shí)別出當(dāng)年放流群體為59只，即7月放流蟹占回捕蟹群體的比例為16.43%；8月共回捕到115只，從回捕群體中識(shí)別出當(dāng)年放流群體為3只，即8月放流蟹占回捕蟹群體的比例為2.61%；9月共回捕到1167只，從回捕群體中識(shí)別出當(dāng)年放流群體為56只，即9月放流蟹占回捕蟹群體的比例為4.80%；10月共回捕到30只，從回捕群體中識(shí)別出當(dāng)年放流群體為2只，即10月放流蟹占回捕蟹群體的比例為6.67%(圖5)。

圖4 雌性親蟹的繁殖貢獻(xiàn)率Fig.4 The rate of reproduction contribution in female broodstock swimming crab P. trituberculatus

3 討 論

本試驗(yàn)共使用6對(duì)高多態(tài)性微衛(wèi)星引物，對(duì)2015年遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流開展回捕調(diào)查，通過對(duì)放流個(gè)體開展個(gè)體識(shí)別的方式解析了放流后短時(shí)間內(nèi)回捕到的放流群體占調(diào)查中回捕群體的回捕率(月間回捕到的放流三疣梭子蟹占當(dāng)月回捕蟹群體的比例)以及雌性親蟹對(duì)放流子代群體的繁殖貢獻(xiàn)率。

圖5 月間回捕率曲線Fig.5 Monthly recapture rate curve

3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)

本試驗(yàn)中，所有微衛(wèi)星位點(diǎn)均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性。以驗(yàn)證微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的多態(tài)性信息含量為例，6個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量平均值均在0.9以上，顯示出所應(yīng)用的位點(diǎn)具有極佳的遺傳信息豐富性[29]。在精確的親子鑒定過程中，選擇高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)是重要一環(huán)；此外微衛(wèi)星位點(diǎn)在基因組中的隨機(jī)分布性、擴(kuò)增片段的穩(wěn)定與可重復(fù)性，毛細(xì)管電泳的高強(qiáng)度信號(hào)也是成功鑒定的關(guān)鍵因素[30]。大量的前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[13,31]，上述6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)無疑具備以上特征，適宜用于三疣梭子蟹放流后的回捕追蹤。

3.2 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性

前期研究發(fā)現(xiàn)，增殖放流過程中親本的種質(zhì)質(zhì)量是影響放流群體遺傳多樣性的關(guān)鍵因素[32-33]。如果使用養(yǎng)殖群體或者遺傳多樣性較低的海捕群體作為親本來大量繁育放流群體，很可能造成放流群體遺傳多樣性的下降，甚至威脅當(dāng)?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性[34]。本次試驗(yàn)，因回捕蟹群體的數(shù)量遠(yuǎn)多于雌性繁殖親蟹群體，造成回捕蟹群體的等位基因顯著多于雌性繁殖親蟹群體(P>0.05)，是合理的。因在計(jì)算過程中已經(jīng)考慮到了群體大小的差異性，解析如等位基因豐度等這些遺傳參數(shù)，開展不同群體大小的基因多樣性比較是可行的[27]。筆者發(fā)現(xiàn)，在有效等位基因、等位基因豐度、期望雜合度、無偏期望雜合度和觀測(cè)雜合度這些遺傳參數(shù)中，雌性繁殖親蟹與回捕蟹兩群體無顯著差異(P>0.05)。鑒定結(jié)果顯示，雌性繁殖親蟹群體與當(dāng)?shù)鼗夭缎啡后w的遺傳多樣性維持在較高水平，觀測(cè)雜合度和期望雜合度均高于萊州灣和鴨綠江的野生群體[21,35]。盤錦地區(qū)放流用三疣梭子蟹雌性親蟹具有較高的遺傳多樣性，有利于維持放流后當(dāng)?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性。然而每次增殖放流活動(dòng)中親蟹的使用數(shù)量也極大地影響放流后當(dāng)?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，尤其是甲殼類廣泛存在有繁殖貢獻(xiàn)率不平衡現(xiàn)象[36]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鑒定到的120只回捕子代當(dāng)中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻(xiàn)率為51.67%，親蟹2貢獻(xiàn)率為15.00%，親蟹3貢獻(xiàn)率為5.83%，其他雌性親蟹對(duì)子代的貢獻(xiàn)率僅維持在0.83%～4.17%，且有28只繁殖雌蟹沒有定位到對(duì)應(yīng)子代。在以往的研究中，也檢測(cè)了放流前雌性繁殖親蟹對(duì)即將放流子代的繁殖貢獻(xiàn)率，發(fā)現(xiàn)雌性親本對(duì)子代均有貢獻(xiàn)，最高為29.61%，最低為3.35%，不同親本之間的貢獻(xiàn)率也存在顯著差異(P<0.05)[13]。三疣梭子蟹繁殖親本間繁殖貢獻(xiàn)率極不平衡這種情況，盡管目前沒有太多直接證據(jù)，但是參閱其他水產(chǎn)種類的相關(guān)研究，尤其是甲殼動(dòng)物，多數(shù)是由于廣泛存在的多次交配，精子競(jìng)爭(zhēng)，雌性性別選擇所致[37-40]。在人工放流過程中繁殖雌蟹是人為選擇的，這也可能會(huì)造成繁殖親本間，繁殖貢獻(xiàn)率不平衡的現(xiàn)象。因此在人工放流中，三疣梭子蟹這種繁殖貢獻(xiàn)率極不平衡現(xiàn)象更需要使用較多的雌性親蟹來參與繁育(圖4)。目前使用較少的繁殖親本繁育大量子代用于放流的現(xiàn)象在我國(guó)普遍存在，如盤錦海域的資源修復(fù)，故今后亟需在增殖放流標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)親本數(shù)量加以科學(xué)規(guī)劃，以維持放流群體整體的遺傳多樣性[32-33,41]。此外在本次試驗(yàn)中，回捕群體中放流蟹識(shí)別比例不高，也可能會(huì)存在某些雌性親蟹的對(duì)應(yīng)子代樣本采集不到的現(xiàn)象，從而一定程度上影響了雌性親蟹繁殖貢獻(xiàn)率。另一個(gè)值得注意的是，回捕群體不符合哈迪溫伯格平衡，這可能由于盤錦當(dāng)?shù)爻Ｄ甑娜斯ぴ鲋撤帕?2012—2015年)，極大地影響了三疣梭子蟹群體的自然選擇，也改變了等位基因頻率[42]。

3.3 親權(quán)鑒定

微衛(wèi)星標(biāo)記因具有高多態(tài)性、基因組內(nèi)隨機(jī)分布性、重復(fù)檢測(cè)穩(wěn)定性等特征，是親權(quán)關(guān)系鑒定中的常用遺傳學(xué)檢測(cè)方法[43]。

本試驗(yàn)采用最大似然法(LOD)在回捕群體中開展放流個(gè)體的譜系追蹤，為了提高鑒定準(zhǔn)確率，LOD值不僅大于0，且達(dá)到了95%的置信區(qū)間，以保證個(gè)體識(shí)別結(jié)果的可靠性，故最終從1671只回捕蟹中發(fā)現(xiàn)放流個(gè)體為120只，籍以此評(píng)估放流三疣梭子蟹的月間回捕率(各月間回捕到的放流蟹占當(dāng)月回捕蟹總?cè)后w的比例)為2.61%～16.43%，表明人工放流三疣梭子蟹對(duì)當(dāng)?shù)厝后w產(chǎn)生了一定的補(bǔ)充和經(jīng)濟(jì)效益。本試驗(yàn)回捕率試驗(yàn)結(jié)果與蔡珊珊[32]所論述的在山東海域547只回捕蟹中，發(fā)現(xiàn)約15%為放流蟹的試驗(yàn)結(jié)果相近；但與謝周全等[48-50]的研究結(jié)果不同，其原因在于謝周全等[48-50]所述回捕率指的是通過對(duì)比增殖放流前后相對(duì)資源量變動(dòng)來評(píng)估得到的放流群體對(duì)目標(biāo)海區(qū)三疣梭子蟹資源的貢獻(xiàn)率。

綜上，本試驗(yàn)成果將深化對(duì)三疣梭子蟹增殖放流的認(rèn)知，為這一物種開展科學(xué)的增殖放流提供有益指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)利用微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記技術(shù)跟蹤了遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流過程，發(fā)現(xiàn)放流后苗種短期月間回捕到放流蟹占當(dāng)月回捕蟹群體的比例為2.61%～16.43%。在鑒定到的120只回捕子代當(dāng)中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻(xiàn)率為51.67%，親蟹2貢獻(xiàn)率為15.00%，親蟹3貢獻(xiàn)率為5.83%，其他親蟹對(duì)子代的貢獻(xiàn)率僅維持在0.83%～4.17%，故雌性繁殖親蟹間存在明顯的繁殖貢獻(xiàn)率不平衡現(xiàn)象。