劉濱瑋，劉 帥，姜潔明，翁歆之，楊顏溢，伍明鳴，劉文雷，王子維，王連順，劉 奇，秦玉雪

(1.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.設施漁業(yè)教育部重點實驗室，遼寧 大連 116023； 3.臺州市水產(chǎn)技術推廣總站，浙江 臺州 318000 )

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)俗稱梭子蟹、飛蟹，屬甲殼綱、十足目、梭子蟹科、梭子蟹屬，為大型經(jīng)濟蟹類，生理生命可達2～3年，但3齡者較少，雄性最大的個體體質量可達710 g；雌性個體體質量可達730 g[1]。廣泛分布于西北太平洋沿岸海域，包括日本、韓國、朝鮮、中國、越南及馬來西亞沿海[2-3]。因肉質鮮美，口感細膩，營養(yǎng)豐富，1981年開始被列為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的對象[4-8]。1986—1988年我國營口地區(qū)首次開展人工放流，放流C2期稚蟹共60余萬只[9]。

遼東灣位于渤海東北部，是一個半封閉的淺海灣，水交換能力較弱，水循環(huán)周期約為15 a[10]。沿岸有遼河、大凌河、六股河等多條河流匯入[11]，帶來了大量營養(yǎng)鹽，灣內初級生產(chǎn)力較高，餌料生物充足，具有河口地區(qū)典型的生境特征，曾是包括三疣梭子蟹在內多種經(jīng)濟動物的重要索餌場和產(chǎn)卵場[12-13]。三疣梭子蟹屬雜食性底棲動物，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著調節(jié)餌料生物、小型動植物密度，以及提高水域資源價值的關鍵生態(tài)角色，是開展資源增殖與養(yǎng)護的適宜種類[14]。伴隨20世紀90年代遼東灣沿岸經(jīng)濟崛起[15]，三疣梭子蟹漁業(yè)資源迅速衰退，在2004—2008年，遼東灣盤錦海域難以形成有效的梭子蟹漁汛，故依靠天然群體的自然繁殖來恢復種群規(guī)模并不現(xiàn)實[16-17]。為恢復梭子蟹漁業(yè)資源量，保證漁業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和維持遼東灣生態(tài)系統(tǒng)平衡，自2012年開始，遼東灣海域以每年4—5月間海捕受精的雌性親蟹作為產(chǎn)卵群體，人工孵化出F1代群體，開展規(guī)?；鲋撤帕鳌?015年，全省共放流C2期稚蟹1000余萬只。目前，三疣梭子蟹已成為遼寧省第二大規(guī)模人工增殖種類。

近年來，在我國沿海地區(qū)廣泛開展了三疣梭子蟹放流工作，取得了一定經(jīng)濟效果。然而截至目前，對三疣梭子蟹增殖放流缺乏有效監(jiān)控和定量分析。筆者利用6對高多態(tài)性微衛(wèi)星DNA分子標記，對遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流開展大規(guī)模追蹤調查，以期評估放流后短期時間內各月間回捕到的放流蟹占當月回捕蟹群體的比例(月間回捕率)以及雌性親蟹對回捕到的放流子代群體的貢獻率程度(繁殖貢獻率)，為將來建立科學的放流體系，構建負責任增殖放流新模式提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 三疣梭子蟹增殖放流

2015年增殖放流承擔單位使用50只海捕已受精雌蟹作為繁殖親蟹，經(jīng)暫養(yǎng)、人工繁育等步驟，共產(chǎn)生約500萬只C2期稚蟹，2015年6月，將上述稚蟹放流到盤錦沿岸海域。于當年7月28日—10月3日在盤錦沿岸以地籠網(wǎng)形式開展回捕調查，共獲得1671只三疣梭子蟹樣本，剪其螯足，剝離肌肉冷凍運回實驗室，立刻用無水乙醇多次洗滌后長期保存。

1.2 放流子代三疣梭子蟹個體識別

1.2.1 DNA抽提

采用吸附柱法(TIANamp Marine Animals DNA Kit，中國)從50只雌性繁殖親蟹與1671只回捕蟹的螯足中提取DNA，共計對1721只三疣梭子蟹樣本開展個體識別。同時采用含量為1.00%的瓊脂糖凝膠電泳(DYY-8C型，中國)來檢測DNA提取質量，使用核酸定量分析儀來檢測DNA濃度(K2800，中國)。

1.2.2 微衛(wèi)星引物

共使用6對具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星DNA分子標記開展試驗。在預試驗階段，以上引物可靠性均經(jīng)過野生群體驗證。引物序列參考文獻[18-21]的試驗設計。每對引物均在5′端添加相應的熒光修飾接頭(表1)。

表1 多態(tài)性微衛(wèi)星位點的特征

1.2.3 聚合酶鏈式反應與毛細管電泳

聚合酶鏈式反應流程和體系參照文獻[13]，但每個聚合酶鏈式反應總體積設置為15 μL，為了保證檢測的可靠性，使用上述6對引物對1721只三疣梭子蟹(50只親本，1671只回捕個體)樣本單獨擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用ABI3730XL基因分析儀(Applied Biosystems，美國)基因測序儀開展毛細管電泳，并基于GeneMapper(4.0版本)軟件繪制熒光信號峰圖，最后進行人工校正。在進行毛細管電泳時，設置多組陽性、陰性和空白對照，保證所繪制的基因型數(shù)據(jù)的準確性和可重復性(圖1)。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 親子鑒定

首先使用Microchecker 2.2.3軟件[22]檢測基因型繪制錯誤和無效等位基因頻率情況，采用親緣關系分析軟件Cervus 3.0.7[23]開展親子鑒定及遺傳多樣性分析，所分析的遺傳參數(shù)包括：等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、同時計算非親排除率，分子標記的累積排除率，根據(jù)鑒定成功的位點數(shù)量計算鑒定準確率，最終計算出親本對子代的貢獻率。各親本間的繁殖貢獻率差異經(jīng)SPSS 22.0中的非參數(shù)卡方檢驗，P<0.05認為差異顯著。

圖1 微衛(wèi)星位點代表性分型結果Fig.1 Typical genotype of the microsatellite loci

1.3.2 各月間回捕到的放流蟹占當月回捕蟹群體的比例

2015年6月放流后，于7—10月在盤錦沿岸主要采用地籠網(wǎng)調查的方式開展回捕調查，調查地點見圖2。并基于親子鑒定結果，繪制出盤錦海域放流三疣梭子蟹月間回捕率變化圖，查明各月間回捕到的放流三疣梭子蟹占當月回捕蟹群體的比例變化趨勢。

圖2 盤錦海域回捕調查范圍Fig.2 Investigation area for recapture swimming crab in coastal Panjin area

1.3.3 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性比較

比較雌性繁殖親蟹(50只)與回捕蟹群體(1671只)的遺傳多樣性差異以探討放流事件中雌性繁殖親蟹的遺傳多樣性層次。使用Arlequin 3.5軟件[24]對上述2個群體開展哈迪溫伯格平衡檢驗；使用GenAlEx 6.503軟件[25-26]分析等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和無偏期望雜合度；使用HP Rare 1.0軟件[27]分析等位基因豐度。多重檢驗經(jīng)sequential Bonferroni校正顯著性[28]。雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體間的遺傳指標差異經(jīng)SPSS 22.0中的配對樣本t檢驗，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1 微衛(wèi)星擴增片段分析

本試驗所使用的6對高多態(tài)性微衛(wèi)星引物在三疣梭子蟹群體中均能獲得穩(wěn)定的、高強度的毛細管檢測信號(圖1)。無效等位基因頻率檢測顯示，所有位點均未發(fā)現(xiàn)明顯的無效等位基因干擾(<0.02)(表2、表3)，證實這些引物可以用于后續(xù)的遺傳多樣性分析與親子鑒定。試驗發(fā)現(xiàn)，6對微衛(wèi)星引物共在2個群體中獲得519個等位基因，其中在雌性繁殖親蟹群體成功擴增出176個等位基因；在回捕蟹群體擴增出343個等位基因，此外等位基因出現(xiàn)最多的微衛(wèi)星引物為Pot51，最少的為Ptri1。兩群體中多態(tài)信息含量平均值均大于0.9，也印證了所使用的微衛(wèi)星引物的高多態(tài)性。

表2 三疣梭子蟹雌性繁殖親蟹微衛(wèi)星DNA標記特征參數(shù)

表3 三疣梭子蟹回捕群體微衛(wèi)星DNA標記特征參數(shù)

2.2 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性分析

雌性繁殖親蟹與回捕蟹兩群體開展了遺傳學參數(shù)分析，計算了等位基因、有效等位基因、等位基因豐度、多態(tài)信息含量、期望雜合度、無偏期望雜合度和觀測雜合度等參數(shù)。以上參數(shù)在雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體中成正態(tài)分布(P>0.05，Shapiro-Wilk test，SPSS)，故使用配對樣本t檢驗雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性差異發(fā)現(xiàn)，除回捕蟹群體的等位基因(57.167)顯著大于雌性繁殖親蟹群體(29.333)外，其他遺傳學參數(shù)在兩群體間均無顯著差異(P>0.05，SPSS)，證實三疣梭子蟹增殖放流所使用的雌性繁殖親蟹遺傳多樣性較高。同時就整體而言，雌性繁殖親蟹群體盡管樣本數(shù)量遠不及回捕蟹群體，但基因頻率符合哈迪溫伯格平衡(P>0.05，SPSS)，進一步證實所使用的雌性繁殖親蟹群體種質較好(表4)。

表4 雌性繁殖親蟹與回捕群體遺傳參數(shù)顯著性檢驗

2.3 親子鑒定分析

因在三疣梭子蟹人工放流過程中，父本基因型未知，故使用Cervus軟件中的母本鑒定開展親子鑒定。親子鑒定結果顯示，當使用4個微衛(wèi)星分子標記時，累積排除率為0.9979，親子鑒定的準確率為84.17%；微衛(wèi)星分子標記為5個時，累積排除率為0.9993，親子鑒定的準確率為90.83%；微衛(wèi)星分子標記為6個時，累積排除率為0.9997，親子鑒定的準確率為95.83%(表5，圖3)，最終從回捕群體中共發(fā)現(xiàn)120只放流子代。

表5 親權鑒定參數(shù)

圖3 不同微衛(wèi)星位點數(shù)的親子鑒定準確率Fig.3 Identification accuracy of different microsatellites for parental authority

2.4 繁殖貢獻率分析

本試驗結果顯示，在所檢測的樣本中，有22只雌性繁殖親蟹在1671只回捕蟹群體中鑒定到其所產(chǎn)子代，占所檢測的雌性繁殖親蟹總樣本的44%。但各雌性繁殖親蟹對子代的繁殖貢獻率存在顯著差異(χ2=142.050，自由度=6，P<0.001，非參數(shù)卡方檢驗)。在鑒定到的120只回捕子代當中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻率為51.67%，親蟹2貢獻率為15.00%，親蟹3貢獻率為5.83%，其他親蟹對子代的貢獻率僅維持在0.83%～4.17%(圖4)。

2.5 盤錦海域放流三疣梭子蟹月間回捕分析

本次三疣梭子蟹回捕調查歷時4個月，其中7月共回捕到359只，基于分子標記，從回捕蟹群體中識別出當年放流群體為59只，即7月放流蟹占回捕蟹群體的比例為16.43%；8月共回捕到115只，從回捕群體中識別出當年放流群體為3只，即8月放流蟹占回捕蟹群體的比例為2.61%；9月共回捕到1167只，從回捕群體中識別出當年放流群體為56只，即9月放流蟹占回捕蟹群體的比例為4.80%；10月共回捕到30只，從回捕群體中識別出當年放流群體為2只，即10月放流蟹占回捕蟹群體的比例為6.67%(圖5)。

圖4 雌性親蟹的繁殖貢獻率Fig.4 The rate of reproduction contribution in female broodstock swimming crab P. trituberculatus

3 討 論

本試驗共使用6對高多態(tài)性微衛(wèi)星引物，對2015年遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流開展回捕調查，通過對放流個體開展個體識別的方式解析了放流后短時間內回捕到的放流群體占調查中回捕群體的回捕率(月間回捕到的放流三疣梭子蟹占當月回捕蟹群體的比例)以及雌性親蟹對放流子代群體的繁殖貢獻率。

圖5 月間回捕率曲線Fig.5 Monthly recapture rate curve

3.1 微衛(wèi)星位點

本試驗中，所有微衛(wèi)星位點均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性。以驗證微衛(wèi)星DNA標記的多態(tài)性信息含量為例，6個位點的多態(tài)性信息含量平均值均在0.9以上，顯示出所應用的位點具有極佳的遺傳信息豐富性[29]。在精確的親子鑒定過程中，選擇高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點是重要一環(huán)；此外微衛(wèi)星位點在基因組中的隨機分布性、擴增片段的穩(wěn)定與可重復性，毛細管電泳的高強度信號也是成功鑒定的關鍵因素[30]。大量的前期試驗發(fā)現(xiàn)[13,31]，上述6個微衛(wèi)星位點無疑具備以上特征，適宜用于三疣梭子蟹放流后的回捕追蹤。

3.2 雌性繁殖親蟹與回捕蟹群體遺傳多樣性

前期研究發(fā)現(xiàn)，增殖放流過程中親本的種質質量是影響放流群體遺傳多樣性的關鍵因素[32-33]。如果使用養(yǎng)殖群體或者遺傳多樣性較低的海捕群體作為親本來大量繁育放流群體，很可能造成放流群體遺傳多樣性的下降，甚至威脅當?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性[34]。本次試驗，因回捕蟹群體的數(shù)量遠多于雌性繁殖親蟹群體，造成回捕蟹群體的等位基因顯著多于雌性繁殖親蟹群體(P>0.05)，是合理的。因在計算過程中已經(jīng)考慮到了群體大小的差異性，解析如等位基因豐度等這些遺傳參數(shù)，開展不同群體大小的基因多樣性比較是可行的[27]。筆者發(fā)現(xiàn)，在有效等位基因、等位基因豐度、期望雜合度、無偏期望雜合度和觀測雜合度這些遺傳參數(shù)中，雌性繁殖親蟹與回捕蟹兩群體無顯著差異(P>0.05)。鑒定結果顯示，雌性繁殖親蟹群體與當?shù)鼗夭缎啡后w的遺傳多樣性維持在較高水平，觀測雜合度和期望雜合度均高于萊州灣和鴨綠江的野生群體[21,35]。盤錦地區(qū)放流用三疣梭子蟹雌性親蟹具有較高的遺傳多樣性，有利于維持放流后當?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性。然而每次增殖放流活動中親蟹的使用數(shù)量也極大地影響放流后當?shù)毓逃腥后w的遺傳多樣性與親緣關系，尤其是甲殼類廣泛存在有繁殖貢獻率不平衡現(xiàn)象[36]。試驗發(fā)現(xiàn)，在鑒定到的120只回捕子代當中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻率為51.67%，親蟹2貢獻率為15.00%，親蟹3貢獻率為5.83%，其他雌性親蟹對子代的貢獻率僅維持在0.83%～4.17%，且有28只繁殖雌蟹沒有定位到對應子代。在以往的研究中，也檢測了放流前雌性繁殖親蟹對即將放流子代的繁殖貢獻率，發(fā)現(xiàn)雌性親本對子代均有貢獻，最高為29.61%，最低為3.35%，不同親本之間的貢獻率也存在顯著差異(P<0.05)[13]。三疣梭子蟹繁殖親本間繁殖貢獻率極不平衡這種情況，盡管目前沒有太多直接證據(jù)，但是參閱其他水產(chǎn)種類的相關研究，尤其是甲殼動物，多數(shù)是由于廣泛存在的多次交配，精子競爭，雌性性別選擇所致[37-40]。在人工放流過程中繁殖雌蟹是人為選擇的，這也可能會造成繁殖親本間，繁殖貢獻率不平衡的現(xiàn)象。因此在人工放流中，三疣梭子蟹這種繁殖貢獻率極不平衡現(xiàn)象更需要使用較多的雌性親蟹來參與繁育(圖4)。目前使用較少的繁殖親本繁育大量子代用于放流的現(xiàn)象在我國普遍存在，如盤錦海域的資源修復，故今后亟需在增殖放流標準中對親本數(shù)量加以科學規(guī)劃，以維持放流群體整體的遺傳多樣性[32-33,41]。此外在本次試驗中，回捕群體中放流蟹識別比例不高，也可能會存在某些雌性親蟹的對應子代樣本采集不到的現(xiàn)象，從而一定程度上影響了雌性親蟹繁殖貢獻率。另一個值得注意的是，回捕群體不符合哈迪溫伯格平衡，這可能由于盤錦當?shù)爻Ｄ甑娜斯ぴ鲋撤帕?2012—2015年)，極大地影響了三疣梭子蟹群體的自然選擇，也改變了等位基因頻率[42]。

3.3 親權鑒定

微衛(wèi)星標記因具有高多態(tài)性、基因組內隨機分布性、重復檢測穩(wěn)定性等特征，是親權關系鑒定中的常用遺傳學檢測方法[43]。

本試驗采用最大似然法(LOD)在回捕群體中開展放流個體的譜系追蹤，為了提高鑒定準確率，LOD值不僅大于0，且達到了95%的置信區(qū)間，以保證個體識別結果的可靠性，故最終從1671只回捕蟹中發(fā)現(xiàn)放流個體為120只，籍以此評估放流三疣梭子蟹的月間回捕率(各月間回捕到的放流蟹占當月回捕蟹總群體的比例)為2.61%～16.43%，表明人工放流三疣梭子蟹對當?shù)厝后w產(chǎn)生了一定的補充和經(jīng)濟效益。本試驗回捕率試驗結果與蔡珊珊[32]所論述的在山東海域547只回捕蟹中，發(fā)現(xiàn)約15%為放流蟹的試驗結果相近；但與謝周全等[48-50]的研究結果不同，其原因在于謝周全等[48-50]所述回捕率指的是通過對比增殖放流前后相對資源量變動來評估得到的放流群體對目標海區(qū)三疣梭子蟹資源的貢獻率。

綜上，本試驗成果將深化對三疣梭子蟹增殖放流的認知，為這一物種開展科學的增殖放流提供有益指導。

4 結 論

本試驗利用微衛(wèi)星DNA分子標記技術跟蹤了遼東灣盤錦海域三疣梭子蟹增殖放流過程，發(fā)現(xiàn)放流后苗種短期月間回捕到放流蟹占當月回捕蟹群體的比例為2.61%～16.43%。在鑒定到的120只回捕子代當中，有87只來自3只雌性繁殖親蟹，其中親蟹1貢獻率為51.67%，親蟹2貢獻率為15.00%，親蟹3貢獻率為5.83%，其他親蟹對子代的貢獻率僅維持在0.83%～4.17%，故雌性繁殖親蟹間存在明顯的繁殖貢獻率不平衡現(xiàn)象。