黃天舒,裴麗鵬

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，2018年發(fā)病率為3.2%，是20～39歲女性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1-2]。在宮頸癌早期患者行手術(shù)切除治療，但是影響了年輕女性患者的生育能力，使得患者的生存質(zhì)量和生命健康大打折扣。晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌的可用治療方法卻有限，放療和化療引起的毒副反應(yīng)通常會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且目前基本無法治愈[3]。雖然有效的巴氏涂片篩查技術(shù)提高了宮頸癌患者的診斷率，以及CryoPen和熱凝等技術(shù)已改善了宮頸癌的預(yù)防，但每年發(fā)生的宮頸癌病例數(shù)量仍然不斷增加[4-5]。因此急需開辟宮頸癌新的治療策略。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌發(fā)病的高危因素[6]，但是HPV感染的細(xì)胞發(fā)展為腫瘤細(xì)胞還需要其他的因素[7]。研究報道，HPV可誘導(dǎo)微小RNA-135a(microRNA-135a, miR-135a)的表達(dá)以促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)化和進(jìn)展，與癌前病變相比，miR-135a在惡性宮頸鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)[8]。miR-135a可能是宮頸癌癌變過程中發(fā)揮重要作用的miRNA。miRNA通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合發(fā)揮其調(diào)控作用[9]，因此本研究通過分析miR-135a調(diào)控的靶基因研究miR-135a在宮頸癌中發(fā)揮重要作用的分子機(jī)制，獲得miR-135a作為宮頸癌治療候選靶點的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑和材料 宮頸癌細(xì)胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細(xì)胞H8(中國上海細(xì)胞庫)，培養(yǎng)基、FBS和胰酶(美國Giboc公司)，Trizol試劑(日本TaKaRa公司)，Bestar 1st Strand cDNA合成試劑盒(上海DBI? Bioscience公司)，OneStep RT-PCR Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)，miR-135a、PTEN、內(nèi)參U6和GAPDH引物(上海捷瑞生物工程有限公司合成)，pGLO-PTEN-野生型質(zhì)粒(PTEN-wt)、pGLO-PTEN-突變型質(zhì)粒(PTEN-mut)購自上海吉凱公司；雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒(英國Abcam公司)，miR-135a inhibitor和PTEN siRNA(廣州瑞博生物技術(shù)有限公司)，MTt試劑(上海碧云天生物試劑有限公司)，流式細(xì)胞儀(南京凱基生物技術(shù)有限公司)，Transwell小室(美國millipore公司)，RIPA(北京索萊寶試劑有限公司)，BCA(美國Thermo公司)，Akt、pAkt、mTOR和pmTOR抗體(美國proteintech公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮中取出的宮頸癌細(xì)胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細(xì)胞H8復(fù)蘇后立即重懸至含有10% FBS的培養(yǎng)基中。C33A細(xì)胞培養(yǎng)基為MEM、Caski細(xì)胞培養(yǎng)基為RPMI1640、HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-高糖，H8細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM-F12。細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2、全濕度培養(yǎng)箱中。細(xì)胞隔天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞長滿時，PBS洗1次，胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3qRT-PCR C33A、Caski、HeLa和H8細(xì)胞長滿后，PBS洗1次，棄掉PBS后加入Trizol試劑，冰上裂解10 min后移至EP管中，加入氯仿混勻后離心，吸取上層上清液移至新的EP管中加入異丙醇混勻后離心，棄掉液體后加入乙醇洗1次，棄掉乙醇后加入無RNA酶雙蒸水溶解RNA，測得RNA的濃度。采用Bestar 1st Strand cDNA試劑盒，按照85℃ 5 s，37℃ 15 min反應(yīng)條件將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用RT-PCR試劑盒，以cDNA為模板，95℃預(yù)變性5 s，95℃變性5 s、65℃退火延伸34 s，變性和退火延伸循環(huán)40個后測得各樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle， Ct)，按照2-ΔΔCt公式以U6為內(nèi)參計算宮頸癌細(xì)胞和永生化宮頸上皮細(xì)胞中miR-135a的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參計算宮頸癌細(xì)胞和永生化宮頸上皮細(xì)胞中十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)mRNA的相對表達(dá)量。miR-135a引物序列F:5′-GCCTCGCTGTTCTCTATGG-3′,R:5′-TGTCCCCGCCGTGCG-3′。PTEN引物序列F:5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′,R:5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′。U6引物序列F:5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′,R:5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。GAPDH引物序列F:5′-GTGAACCATGAGAAGTATG-3′,R:5′-CGGCCATCACGCCACAGTTTC-3′。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-135a表達(dá)較高的宮頸癌細(xì)胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細(xì)胞計數(shù)，以1×105個細(xì)胞接種至6孔板中，分為NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組。細(xì)胞接種12 h后采用Lip2000進(jìn)行小分子化合物轉(zhuǎn)染，無關(guān)序列轉(zhuǎn)染NC組細(xì)胞，miR-135a抑制劑(inhibitor)轉(zhuǎn)染miR-135a inhibitor組細(xì)胞，miR-135a inhibitor和PTEN siRNA同時轉(zhuǎn)染miR-135a inhibitor+si-PTEN組細(xì)胞，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h更換新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR檢測各組轉(zhuǎn)染效果。

1.5驗證miR-135a靶向調(diào)控PTEN TargetScan7.1軟件(http://www.targetscan.org/)預(yù)測miR-135a可能的靶基因。miR-135a表達(dá)較高的宮頸癌細(xì)胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細(xì)胞計數(shù)，以每孔2000個接種到96孔板中，分為NC+PTEN-wt組(無關(guān)序列與PTEN-wt同時轉(zhuǎn)染)；miR-135a+PTEN-wt組(miR-135a inhibitor與PTEN-wt同時轉(zhuǎn)染)；NC+PTEN-mut組(無關(guān)序列與PTEN-mut同時轉(zhuǎn)染)；miR-135a+PTEN-mut組(miR-135a inhibitor與PTEN-mut同時轉(zhuǎn)染)，收集轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，采用雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。qRT-PCR檢測NC和miR-135a inhibitor組細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)。

1.6MTT實驗 miR-135a表達(dá)較高的宮頸癌細(xì)胞長滿時，PBS洗1次，采用胰酶消化收集細(xì)胞計數(shù)，以每孔1500個細(xì)胞接種到96孔板中，分為NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組，進(jìn)行各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染0、24、48和72 h時，每孔加入20 μl MTT試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)基后每孔加入150 μl DMSO試劑。酶標(biāo)儀檢測各樣品在490 nm處的吸光度(OD)值。

1.7凋亡實驗 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗1次后，采用無EDTA的胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗2次后，各孔加入500 μl的凋亡染色緩沖液重懸細(xì)胞，依次加入5 μl PI和5 μl Annexin V-FITC染色常溫避光孵育進(jìn)行細(xì)胞染色，15 min后流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.8Transwell實驗 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗1次后，采用胰酶消化收集各組細(xì)胞，PBS洗2次后細(xì)胞計數(shù)，1×105個細(xì)胞加入到100 μl無血清培養(yǎng)基中混勻，加入到Transwell小室的上室底部，下室加入含有10% FBS的完全培養(yǎng)基中。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后終止培養(yǎng)，未穿過的細(xì)胞采用PBS洗去后，采用甲醇固定10 min、吉姆薩染色5 min，干燥后顯微鏡下拍照計數(shù)穿膜的細(xì)胞個數(shù)。

1.9Western blot檢測蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗1次，棄掉PBS后加入RIPA試劑，冰上裂解10 min后移至EP管中，超聲震蕩20 min后低溫14 000 r/min離心30 min，獲得蛋白裂解液。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白裂解液中加入上樣緩沖液煮沸后制備變性蛋白。50 μg蛋白加入SDS-PAGE膠中電泳進(jìn)行蛋白分離，濕性轉(zhuǎn)膜方法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，8%脫脂牛奶孵育PVDF膜1 h封閉非特異性蛋白，一抗稀釋液Akt、pAkt、mTOR、pmTOR和內(nèi)參GAPDH 4℃孵育過夜，抗稀釋液室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1miR-135a和PTEN在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測miR-135a和PTEN分別在宮頸癌細(xì)胞C33A、Caski、HeLa和永生化宮頸上皮細(xì)胞H8中的表達(dá)水平。miR-135a在宮頸癌細(xì)胞C33A、Caski、HeLa中的表達(dá)水平高于永生化宮頸上皮細(xì)胞H8，且Caski、HeLa高于C33A，HeLa低于Caski(P<0.05);PTEN mRNA在宮頸癌細(xì)胞C33A、Caski、HeLa中的表達(dá)水平低于永生化宮頸上皮細(xì)胞H8，且Caski、HeLa低于C33A，HeLa高于Caski(P<0.05)。見表1。選擇miR-135a表達(dá)水平較高的宮頸癌細(xì)胞Caski進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 miR-135a和PTEN在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.2miR-135a對PTEN的靶向調(diào)控作用 TargetScan7.1軟件在線預(yù)測顯示PTEN啟動子區(qū)與miR-135a具有結(jié)合位點，見圖1。雙熒光素酶報道基因試驗結(jié)果顯示，NC+PTEN-wt組、miR-135a+PTEN-wt組、NC+PTEN-mut組、miR-135a+PTEN-mut組熒光素酶活性分別為1.00±0.03、2.51±0.12、1.00±0.04、1.08±0.09。與NC+PTEN-wt組相比，miR-135a+PTEN-wt組熒光素酶活性增加(P<0.01)；NC+PTEN-mut組與miR-135a+PTEN-mut組熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。提示miR-135a可靶向調(diào)控PTEN。

圖1 PTEN啟動子區(qū)與miR-135a的結(jié)合位點PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 選擇miR-135a表達(dá)較高的宮頸癌細(xì)胞Caski進(jìn)行miR-135a inhibitor和PTEN siRNA的轉(zhuǎn)染，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-135a inhibitor組中miR-135a的表達(dá)降低(P<0.01)。表明miR-135a inhibitor成功轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組PTEN mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。表明miR-135a負(fù)調(diào)控PTEN mRNA的表達(dá)。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組中PTEN mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。表明PTEN siRNA成功轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞。見表2。

表2 3組宮頸癌細(xì)胞Caski轉(zhuǎn)染效率比較

2.4miR-135a調(diào)控PTEN對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響 MTT實驗檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞增殖能力降低。而與miR-135a inhibitor 組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞增殖能力增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的抑制作用。見圖2。

圖2 miR-135a調(diào)控PTEN對Caski細(xì)胞增殖能力的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物,OD為吸光度；與NC組比較，aP<0.05；與miR-135a inhibitor組，cP<0.05

2.5miR-135a調(diào)控PTEN對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞凋亡率分別為(2.03±0.21)%、(14.96±2.38)%、(6.31±1.08)%。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。見圖3。

圖3 miR-135a調(diào)控PTEN對Caski細(xì)胞凋亡的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.6miR-135a調(diào)控PTEN對宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，NC組、miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞穿膜數(shù)分別為(89.67±4.22)個、(40.33±3.84)個、(63.33±2.88)個。與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低(P<0.05)。與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。見圖4。

圖4 miR-135a調(diào)控PTEN對Caski細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響(吉姆薩染色×200)PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

2.7miR-135a調(diào)控PTEN對Akt/mTOR的影響 Western blot實驗檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-135a inhibitor組和miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞中pAkt和pmTOR蛋白表達(dá)降低，而與miR-135a inhibitor組相比，miR-135a inhibitor+si-PTEN組Caski細(xì)胞中pAkt和pmTOR蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。提示PTEN siRNA減弱miR-135a inhibitor對Akt/mTOR信號通路的抑制作用。見圖5，表3。

圖5 miR-135a負(fù)靶向調(diào)控PTEN對Akt/mTOR的影響PTEN為十號染色體上缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物

表3 3組宮頸癌細(xì)胞中pAkt和pmTOR蛋白的相對表達(dá)量

3 討論

宮頸癌已成為全世界女性中第四大最常見的腫瘤，占全世界與腫瘤相關(guān)死亡的很大比例[1]。由于不同地區(qū)生活質(zhì)量和醫(yī)療資源分配不均的差異，75%的宮頸癌患者發(fā)生在資源匱乏的發(fā)展中國家，由于早期診斷準(zhǔn)確率低，患者確診時已處于晚期[9]。而研究報道國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分期Ⅰ期患者的存活率為80%～98%，但當(dāng)患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時，其存活率降低至50%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是患者死亡的主要原因，所以宮頸癌仍然是發(fā)展中國家婦女與腫瘤相關(guān)死亡的最主要原因[3]。同時HPV感染和性行為的改變導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)病率居高不下[7]。盡管宮頸癌治療在化療、放療和外科治療方面已取得了很大的進(jìn)步，以及分子靶向治療、免疫治療和生物治療等新型治療方式的發(fā)展與應(yīng)用，但是宮頸癌患者的預(yù)后仍然很差[10]。目前宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，因此在分子水平研究宮頸癌發(fā)病機(jī)制對其治療具有重要意義。

miRNA是一組內(nèi)源性的小分子非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、凋亡和分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)證實，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)與在良性和正常組織中的表達(dá)模式不同，miRNA在腫瘤組織中高表達(dá)或者低表達(dá)，異常表達(dá)的miRNA可作為腫瘤檢測或預(yù)后評估的分子標(biāo)志物[11]。越來越多的研究報道，異常表達(dá)的miRNA在人類惡性腫瘤中除了作為各類分子標(biāo)志物，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也充當(dāng)重要角色[12]。在宮頸癌中異常表達(dá)的miRNA也逐漸被發(fā)現(xiàn)，Leung等[8]比較了激光捕獲顯微切割的宮頸標(biāo)本中miR-135a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與癌前病變相比，宮頸癌中miR-135a的表達(dá)上調(diào)，且過表達(dá)miR-135a后，永生化宮頸上皮細(xì)胞系NC104-E6/E7的增殖和侵襲能力增加。miR-135a在食管癌、鼻咽癌和非小細(xì)胞肺癌等多種細(xì)胞中被報道為腫瘤抑癌miRNA[13-15]，而在子宮內(nèi)膜癌中miR-135a促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，并降低順鉑敏感性[16]。由此可見，miR-135a可發(fā)揮抑癌作用和促癌作用。但Chen等[17]報道，miR-135a在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-135a的過表達(dá)顯著抑制細(xì)胞增殖和遷移能力，其作用靶點是ASPH基因。Wang等[16]報道，miR-135a通過靶向AKT信號通路發(fā)揮促子宮內(nèi)膜癌的作用，因此靶基因是miRNA發(fā)揮作用的關(guān)鍵。Leung等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a通過靶向SIAH1基因參與宮頸癌的進(jìn)展。我們通過研究miR-135a新靶基因分析miR-135a在宮頸癌中新的生物學(xué)功能及作用機(jī)制。

本研究采用qRT-PCR檢測miR-135a在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與永生化宮頸上皮細(xì)胞H8相比，miR-135a在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)增加，并選擇miR-135a高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞Caski進(jìn)行生物學(xué)功能研究，抑制miR-135a的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力降低，與Leung等[8]的研究一致。在子宮內(nèi)膜癌中miR-135a高表達(dá)通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡降低細(xì)胞對化療藥物的敏感性[16]，因此本文檢測miR-135a對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-135a的表達(dá)，宮頸癌細(xì)胞的凋亡增加，表明miR-135a密切參與宮頸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡。為了研究miR-135a的靶基因，本研究采用Targetscan7.1預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)PTEN基因的3'-UTR與miR-135a有結(jié)合位點。PTEN是經(jīng)典的抑癌基因，在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與宮頸癌的臨床病理參數(shù)和預(yù)后不良相關(guān)[18]。同時PTEN低表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制細(xì)胞的凋亡[19]。本研究采用雙熒光素酶報道基因試驗檢測發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中miR-135a靶向調(diào)控PTEN基因，并且采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PTEN在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)下降，與已有的研究一致[20]。在抑制miR-135a表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染PTEN siRNA后，生物學(xué)功能實驗發(fā)現(xiàn)，PTEN siRNA可以部分恢復(fù)抑制miR-135a表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，減少了細(xì)胞凋亡。表明miR-135a通過靶向PTEN在宮頸癌中發(fā)揮促癌作用。在子宮內(nèi)膜癌中miR-135a可調(diào)控AKT信號通路發(fā)揮促癌作用[16]，研究報道Akt/mTOR信號通路在宮頸癌中激活后促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性表型，并可以作為腫瘤治療的靶點[20]。本研究結(jié)果顯示，miR-135a inhibitor抑制細(xì)胞中pAkt和pmTOR蛋白的表達(dá)，干擾PTEN的表達(dá)減弱了miR-135a inhibitor對宮頸癌細(xì)胞中pAkt和pmTOR蛋白表達(dá)的抑制作用。表明miR-135a在宮頸癌中靶向PTEN調(diào)控Akt/mTOR信號通路。

綜上所述，miR-135a靶向抑制PTEN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，抑制細(xì)胞凋亡，可能通過調(diào)控Akt/mTOR信號通路發(fā)揮作用。miR-135a可能是治療宮頸癌的潛在靶點。