梅 晗，周 輝，陳煜楓，胡 燕，蔚 嵐，王小妹

胰腺癌因其隱匿發(fā)病及早期診斷困難，成為極度惡性的腫瘤之一，5年生存率僅6%，近些年來其發(fā)病率和病死率都表現(xiàn)出逐步上升的趨向[1-2]。到目前為止胰腺癌的發(fā)病原因仍處于不明確的狀態(tài)，有研究表明，機(jī)體炎癥、黏附因子表達(dá)水平及免疫功能失調(diào)在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中起著相當(dāng)重要的作用[3-5]。在選擇素家族中的內(nèi)皮細(xì)胞選擇素(E-selectin)和血小板選擇素(P-selection)介導(dǎo)下，外周血中游離的腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等相互之間發(fā)生黏附作用，成為炎癥形成和胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因[6]。原癌基因K-ras在正常人體中呈野生型存在，但可在90%以上胰腺癌患者中發(fā)生突變，是胰腺癌早期診斷中最具組織相對(duì)特異性的重要指標(biāo)[7]。目前很少有關(guān)于胰腺癌外周血中E-selectin、P-selection水平檢測(cè)及外周血K-ras基因突變情況的研究。本研究通過檢測(cè)胰腺癌患者外周血中E-selectin、P-selection含量及K-ras基因第12、13密碼子突變情況，探討這些指標(biāo)與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及在早期診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選擇我院2019年2月—2020年2月收治的60例胰腺癌，男32例，女28例，年齡46～67(55.21±3.69)歲。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer， AJCC)建立的TNM國際分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期26例;有29例發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,10例伴肝臟轉(zhuǎn)移;腫瘤位于胰頭部41例，位于胰體、胰尾部19例。選擇同時(shí)期于我院體檢的健康人60例作為對(duì)照組，男31例，女29例，年齡40～66(52.04±4.27)歲。2組年齡、性別等方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組者均簽署知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：行組織學(xué)及K-ras基因突變檢測(cè)后，經(jīng)臨床病理學(xué)診斷為胰腺癌的患者；臨床資料完整；檢測(cè)前未進(jìn)行放、化療治療；無全身系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期出現(xiàn)急性感染性疾?。挥兴幬餅E用史；長期酗酒；伴有其他部位惡性腫瘤疾病。

1.3方法

1.3.1外周血E-selectin、P-selection濃度測(cè)定：抽取入組者空腹靜脈血4 ml放入無內(nèi)毒素以及熱源的干燥試管，3000 r/min離心10 min后小心迅速地將血清和紅細(xì)胞分離。按試驗(yàn)操作說明利用雙抗夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)E-selectin及P-selection水平，檢測(cè)試劑盒由百奧萊博(北京)科技有限公司提供，按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行操作，吸光度(OD值)是由美國Thermo Fisher公司生產(chǎn)的Multiskan FC酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定，然后根據(jù)OD值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算濃度值。

1.3.2檢測(cè)外周血K-ras基因第12、13密碼子情況：將1 ml靜脈血置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管中，按照由哈靈(上海)生物科技有限公司購買的試劑盒說明書，以酚氯仿法提取DNA。參考現(xiàn)有研究，利用肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)外周血中K-ras基因第12、13密碼子突變情況[8]，引物上游序列：5'-TACTGGTGGAGTATTTGATA-3',下游序列：5'-CAAGATTTACCTCTATTGTT-3'，肽核酸序列：NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-HAc。反應(yīng)條件：95℃條件下預(yù)變性1 min、變性15 s，70℃肽核酸結(jié)合10 s，60℃引物退火及延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，分析Ct值。樣本含有突變型基因和野生型基因的融解溫度分別為80.8℃和83.5℃。

2 結(jié)果

2.1外周血E-selectin、P-selection水平 胰腺癌組外周血E-selectin水平高于對(duì)照組，而P-selection水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組外周血E-selectin、P-selection水平比較

2.2胰腺癌患者外周血E-selectin、P-selection水平與臨床病理特征的關(guān)系 Ⅲ～Ⅳ期患者E-selectin水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，P-selection水平低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01)。胰腺癌伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的患者外周血中E-selectin水平高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的患者，P-selection水平低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的患者(P<0.01)。外周血E-selectin、P-selection水平與腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 60例胰腺癌外周血E-selectin、P-selection水平與臨床病理特征關(guān)系

2.3胰腺癌外周血E-selectin與P-selection相關(guān)性分析 胰腺癌組外周血E-selectin與P-selection水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9158，P<0.01)。見圖1。

圖1 胰腺癌患者外周血E-selectin與P-selection水平相關(guān)性分析E-selectin為內(nèi)皮細(xì)胞選擇素，P-selection為血小板選擇素

2.4外周血K-ras基因突變與組織K-ras基因突變情況 60例正常人外周血K-ras基因全部為野生型。60例胰腺癌中有29例發(fā)生外周血K-ras基因突變，45例組織中發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變，二者突變一致性為79.3%(23/29)，外周血K-ras基因突變率為48.3%(29/60)。見表3。

表3 60例胰腺癌患者外周血K-ras基因突變與組織K-ras基因突變情況(例)

2.5胰腺癌患者外周血K-ras基因突變情況與臨床病理特征的關(guān)系 胰腺癌患者外周血K-ras基因突變與性別相關(guān)(P<0.05)，男性患者的基因多呈野生型，而女性患者的基因多呈突變型。外周血K-ras基因突變與胰腺癌患者年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)及肝轉(zhuǎn)移和腫瘤部位無關(guān)(P>0.05)。見表4。

表4 60例胰腺癌患者中外周血K-ras基因突變與臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

眾所周知胰腺癌是目前世界上最具侵襲性的腫瘤之一。有資料表明，估計(jì)到2030年胰腺癌的病死率將超越乳腺、前列腺和結(jié)直腸惡性腫瘤，成為僅次于肺癌的第二大癌癥相關(guān)致死性疾病[9-11]。胰腺癌患者早期無明顯癥狀，且體檢意識(shí)較差，部分早期胰腺癌常規(guī)影像學(xué)檢查不能很好地分辨，導(dǎo)致大部分患者確診時(shí)多為局部晚期，55%胰腺癌患者在確診時(shí)已伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無法進(jìn)行手術(shù)治療[12-13]。在過去20年里，隨著新研究的不斷開展以及臨床試驗(yàn)的不斷進(jìn)行，胰腺癌在治療方面取得了一定的成果，但預(yù)后效果仍不夠理想[14]。既往胰腺癌侵入性檢查方法對(duì)人體損傷大、價(jià)格昂貴，部分年紀(jì)較大、體質(zhì)較差的患者無法耐受，對(duì)早期診斷、復(fù)查和隨訪造成很大的困難，外周血取樣損傷小、方法簡單，易被初診及需要多次復(fù)查的患者接受，越來越成為惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的重要手段。探查胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制是胰腺癌目前重要研究方向，對(duì)惡性腫瘤的預(yù)防、早期篩查和診斷至關(guān)重要，也可為臨床治療提供新的切入點(diǎn)。

E-selectin和P-selection同時(shí)也作為黏附因子，在外周血管中介導(dǎo)腫瘤的血行轉(zhuǎn)移，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中重要的參與因素[15]。原發(fā)病灶的腫瘤細(xì)胞有一部分會(huì)脫落并進(jìn)入外周血管，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞，在外周血管中引起一系列變化。首先，在刺激因素作用下，E-selectin介導(dǎo)循環(huán)血液中白細(xì)胞與血管壁接觸、黏附，促使白細(xì)胞向血管外遷移，為癌細(xì)胞的生存和生長提供了有利的環(huán)境。然后，使血管中循環(huán)腫瘤細(xì)胞向組織浸潤，進(jìn)而引起腫瘤向血管外的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移灶的生長。組織浸潤的過程進(jìn)一步刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)E-selectin在外周血中表達(dá)[16]。另一方面，外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的表面配體在相同刺激因素作用下與P-selection結(jié)合，使外周血中游離腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞接觸黏附、遷移，通過這種方式調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[17]。因此推測(cè)，阻斷E-selectin和P-selection介導(dǎo)的黏附作用可以阻礙胰腺癌發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，胰腺癌組外周血中E-selectin水平高于對(duì)照組，而P-selection水平降低，提示外周血E-selectin和P-selection水平測(cè)定可用于胰腺癌臨床篩查及參與胰腺癌早期診斷。隨著臨床分期的不同以及是否伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，外周血中E-selectin和P-selection水平呈現(xiàn)了相對(duì)應(yīng)的變化，分期越晚、伴有淋巴結(jié)或肝轉(zhuǎn)移的患者外周血中E-selectin水平越高，P-selection水平越低，反之亦然，提示外周血E-selectin和P-selection水平可用于病情判斷及預(yù)后評(píng)估。綜上表明，外周血E-selectin和P-selection水平檢測(cè)可用于胰腺癌的早期診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，有較少一部分腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血，在免疫反應(yīng)作用下癌細(xì)胞溶解，釋放與原發(fā)灶具有相同遺傳信息的DNA[18]。因此從外周血中檢測(cè)的K-ras基因狀態(tài)可反映原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶K-ras基因狀態(tài)。K-ras基因突變通常發(fā)生在第12、13密碼子，這兩個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)對(duì)胰腺癌診斷具有十分重要的意義。本研究結(jié)果顯示，外周血K-ras基因突變率為48.3%，與組織學(xué)檢測(cè)K-ras基因突變一致性達(dá)79.3%，同既往研究結(jié)果相近[19]。與以往檢測(cè)方法不同的是，本研究使用的肽核酸鉗制實(shí)時(shí)定量PCR法的敏感性較高，檢測(cè)外周血K-ras基因突變情況更精準(zhǔn)。對(duì)外周血進(jìn)行K-ras基因檢測(cè)彌補(bǔ)了通過有創(chuàng)及侵入的方式在組織、胰液中取材來檢測(cè)K-ras基因的不足。有研究表明，通過聯(lián)合檢測(cè)外周血K-ras基因和CA19-9指標(biāo)可以明顯提高胰腺癌診斷的敏感性，有望廣泛應(yīng)用于臨床，以便進(jìn)行癌癥的篩查和早期診斷，為臨床用藥提供依據(jù)[20]。

綜上所述，外周血E-selectin和P-selection異常表達(dá)與胰腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，外周血K-ras基因檢測(cè)對(duì)胰腺癌早期篩查、診斷、指導(dǎo)臨床治療有重要作用。多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)為胰腺癌早發(fā)現(xiàn)、早治療提供了新的可能，但仍需進(jìn)一步深入研究。and Its Clinical Implication[J].J Clin Med, 2019,8(6):903.