曹豪豪,張紅兵*,薛溪發(fā),李左群,閆洪波,李會(huì)宣

1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 石家莊 050061;2.河北德諾商品檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司, 石家莊 050061

當(dāng)前化石能源短缺及其應(yīng)用帶來的污染日趨嚴(yán)重，阻礙了世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展，研發(fā)替代能源勢(shì)在必行，生物燃料作為可再生的能源形式潛力巨大，成為研究焦點(diǎn)[1]。微藻是自然界中起源最早、數(shù)量最多、分布最廣的生物種類，是含有葉綠素a的光合作用微生物。由于許多種屬的微藻在生長(zhǎng)過程中能在細(xì)胞內(nèi)大量積累生物質(zhì)，已用于生產(chǎn)沼氣、乙醇、生物柴油、生物氫等環(huán)保、清潔、經(jīng)濟(jì)的生物燃料，是化石燃料的理想替代品，同時(shí)利用藻類生物質(zhì)生產(chǎn)食品和飼料添加劑乃至藥物等也引起了廣泛關(guān)注[2]。

為了充分發(fā)揮微藻生產(chǎn)潛力、優(yōu)化生產(chǎn)工藝，有必要利用分子生物學(xué)技術(shù)研究微藻的遺傳背景，解決脂質(zhì)積累率偏低[3]、固定二氧化碳效率差[4]、培養(yǎng)周期長(zhǎng)[5]等瓶頸問題。由于生物信息學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是新型基因編輯技術(shù)，已經(jīng)成為解決上述問題的重要策略。其中，應(yīng)用最廣泛的是TALEN和CRISPR/Cas9 等基因編輯技術(shù)，在哺乳動(dòng)物、植物等中已取得了較好的效果[6]?；诖?，本文就上述技術(shù)在微藻遺傳改造方面的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為相關(guān)研究提供借鑒。

1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯技術(shù)的核心是通過對(duì)生物體特定DNA片段的插入、敲除、修飾或替換等手段，使預(yù)期基因組序列發(fā)生改變并遺傳，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的編輯[7]。該方法不僅可以研究目的基因的功能，還可以賦予生物體新的生物學(xué)特性。特別是近幾年被稱為分子剪刀的工程核酸酶,極大地促進(jìn)了基因組編輯的發(fā)展，包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)/Cas(CRISPR-associated systems)核酸酶系統(tǒng)。

1.1 ZFN技術(shù)

目前應(yīng)用的ZFN是一類人工合成的核酸內(nèi)切酶，也就是具有特定基因編輯功能的蛋白質(zhì)，由3個(gè)人工設(shè)計(jì)的鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和1個(gè)FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域組成，能特異剪切基因組某段DNA[8]。

ZFN的N末端是DNA的結(jié)合域，一般含3～4個(gè)串聯(lián)的CysHis2鋅指蛋白，其中每個(gè)鋅指蛋白能夠結(jié)合特定靶DNA序列中3 bp的片段；C末端多為非特異性FokⅠ核酸酶結(jié)構(gòu)域，具有核酸內(nèi)切酶活性，能夠切割非特異DNA，切割時(shí)FokⅠ的催化結(jié)構(gòu)域需要以適當(dāng)?shù)膲A基距離形成異二聚體。如圖1所示，為了進(jìn)行有效的二聚化和切割，2個(gè)ZFN分子以尾對(duì)尾方式與相對(duì)鏈上的靶DNA結(jié)合，相間隔5～7 bp，在此間隔區(qū)中可以實(shí)現(xiàn)特定DNA位點(diǎn)的切割[10]。

1.2 TALEN技術(shù)

TALEN的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域源自轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物(transcription activator-like effector，TALE)，該效應(yīng)物是源于植物病原菌黃單胞菌屬(Xanthomonas)[11]。

與ZFN相似，TALEN也包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端為DNA特異性識(shí)別和結(jié)合區(qū)域TALE，C端為與ZFN相同的FokⅠ核酸酶催化結(jié)構(gòu)域。其中TALE由N端轉(zhuǎn)錄信號(hào)、C端核定位信號(hào)、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以及DNA特異性識(shí)別和結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成。在TALE蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中含有由34個(gè)氨基酸組成的鋅指模塊同源重復(fù)序列，其中第12、13位為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基(repeat variant diresidues，RVD)。TALE所識(shí)別的堿基是由不同的RVD所決定的，其中NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、NH識(shí)別G、NN識(shí)別A或G、HD識(shí)別C、NS對(duì)4種堿基都可以識(shí)別，因此經(jīng)過人工編輯TALE的RVD，能夠識(shí)別對(duì)應(yīng)的DNA序列。FokⅠ結(jié)構(gòu)域來自FokⅠ核酸酶的末端活性域，需要二聚化才有活性。所以，在基因編輯的過程中需要2個(gè)TALEN蛋白，如圖2所示，目標(biāo)序列的上游與下游由2個(gè)TALE結(jié)構(gòu)域分別識(shí)別，2個(gè)FokⅠ結(jié)構(gòu)域作用在一段DNA上造成雙鏈斷裂，可以在該位點(diǎn)進(jìn)行插入、敲除或點(diǎn)突變等操作[13-15]。

1.3 CRISPR/Cas技術(shù)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種獲得性免疫系統(tǒng)，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA[16-18]。CRISPR即成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，而 Cas 即 CRISPR 相關(guān)系統(tǒng)，位于 CRISPR序列的上游，包含多種功能蛋白基因[19]。

CRISPR是其中的靶位點(diǎn)識(shí)別組件，CRISPR轉(zhuǎn)錄生成CRISPR-RNA前體(pre-crRNA)，隨后前體被加工成短的成熟的CRISPR-RNA(crRNA)，crRNA將與靶基因DNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行識(shí)別。切割DNA的組件為Cas核酸內(nèi)切酶，CRISPR與Cas結(jié)合形成一種RNA-蛋白質(zhì)的復(fù)合體，RNA特異性識(shí)別結(jié)合DNA，并引導(dǎo)Cas核酸酶特異性切割DNA[20]。

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)可分為TypeⅠ型、TypeⅡ型和Type Ⅲ型3種類型。其中Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)CRISPR/Cas9是目前研究最為充分的系統(tǒng)，如圖3所示，在CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，向?qū)NA(guide RNA，gRNA)代替了上述crRNA和tracrRNA兩者的作用，在gRNA的作用下，識(shí)別靶序列的原型間隔區(qū)相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)位點(diǎn)并引導(dǎo)Cas9核酸酶切割靶位點(diǎn)，通過非同源末端連接或同源重組進(jìn)行修復(fù)以實(shí)現(xiàn)基因的敲除與修飾[22-23]。此外，Cas9蛋白還可在2個(gè)活性位點(diǎn)殘基(D10A和H840A)發(fā)生突變，失去啟動(dòng)DNA雙鏈斷裂(double-strand breaks, DSBs)的能力，形成所謂的CRISPR/dCas9系統(tǒng)，可用于干擾和激活基因表達(dá)[24]。表1比較了3種編輯技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。

圖1 ZFN的作用機(jī)制[9]Fig.1 The mechanism of ZFN[9]

圖2 TALEN的作用機(jī)制[12]Fig.2 The mechanism of TALEN[12]

圖3 CRISPR/Cas9工作機(jī)制[21]Fig.3 The mechanism of CRISPR/Cas9[21]

表1 新型基因編輯技術(shù)的比較Table 1 Comparison of new gene editing technologies

2 基因編輯技術(shù)在微藻中的應(yīng)用

理論上，上述工具酶可以定點(diǎn)修飾任何物種的基因序列。它們結(jié)合到靶基因序列后，通過切割酶破壞靶DNA雙鏈，然后啟動(dòng)非同源末端連接修復(fù)(nonhomologous end joining, NHEJ)或同源重組修復(fù)(homology-directed repair,HDR) 機(jī)制來修復(fù)靶基因，從而產(chǎn)生精確的定點(diǎn)修飾的靶基因而沒有插入任何外源DNA片段，這種定點(diǎn)修飾就成為可以在后代中穩(wěn)定遺傳的變異[25]，在微藻中同樣適用。

2.1 ZFN技術(shù)在微藻中的應(yīng)用

ZFN技術(shù)應(yīng)用于微藻的研究非常少，只有1例。2013年，Sizova等[26]首次將ZFNs技術(shù)應(yīng)用于萊茵衣藻(Chlamydomonasrehardtii，常作為基礎(chǔ)和生物技術(shù)研究的通用模型)，利用ZFNs靶向突變編碼光敏一型視紫紅質(zhì)離子通道的COP3基因。ZFN的不同轉(zhuǎn)化效率是由敲除抗性或熒光標(biāo)記等報(bào)告基因來評(píng)估的，并根據(jù)結(jié)果修飾優(yōu)化模塊組合，選出親和力和特異性最佳的核酸酶結(jié)合外源DNA共轉(zhuǎn)化，實(shí)現(xiàn)對(duì)該藻株靶基因的定點(diǎn)敲除。這項(xiàng)技術(shù)不僅有助于衣藻單個(gè)基因功能的研究，而且還可以實(shí)現(xiàn)有效的基因定點(diǎn)修飾。

2.2 TALEN技術(shù)在微藻中的應(yīng)用

TALEN誘導(dǎo)的靶向基因失活和靶向序列插入的方法，通過重塑硅藻新陳代謝方面的有效性在微藻中得到了證實(shí)。Daboussi等[27]首次將 TALEN 技術(shù)應(yīng)用于硅藻的基因敲除。通過NHEJ介導(dǎo)的修復(fù)產(chǎn)生突變體，敲除了三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中參與油脂代謝的關(guān)鍵基因，其中尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UCPase)基因的敲除突變株的甘油三酯(triacylglycerol, TAG)含量相比野生型藻株提高了45倍，使突變體具有工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

之后的研究中，將TALEN表達(dá)盒與含有與TALEN靶位點(diǎn)同源序列側(cè)翼的抗生素抗性基因的“敲除質(zhì)?！苯Y(jié)合， TALEN與靶基因結(jié)合進(jìn)行切割, “敲除質(zhì)粒”則通過HDR整合到基因組, 敲除三角褐指藻P.tricornutum的尿素酶基因, 基于HDR的靶向插入更易獲得突變體[28]。Hao等[29]通過TALEN基因組編輯技術(shù)破壞了P.tricornutum中硫酯酶基因，成功構(gòu)建了ptTES1基因的敲除突變株，結(jié)果表明盡管微藻生長(zhǎng)受到損害，但與野生型菌株相比，ptTES1基因敲除突變體顯示出更高的TAG生產(chǎn)率，含量提高了1.7倍，證明了TALEN介導(dǎo)的靶基因敲除作為增強(qiáng)含油硅藻中TAG產(chǎn)生的有效策略的潛力。在最近的研究中，Kurita等[30]合成了編碼為產(chǎn)油微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)的Platinum TALENs，并通過在人HEK293T細(xì)胞中的單鏈退火實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們的DNA結(jié)合活性。以硝酸還原酶基因NoNR和酰基轉(zhuǎn)移酶基因LPAT1為靶點(diǎn)，將Platinum TALEN的多合一表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到微綠球藻中。在N.oceanica候選位點(diǎn)沒有可檢測(cè)到的脫靶突變。同時(shí)引入TALENs靶向2個(gè)基因，獲得雙突變株。此外，這些多合一的TALEN載體在大腸桿菌中表現(xiàn)出高特異性和多重性。此研究為創(chuàng)造高性能藻類生物柴油的實(shí)際應(yīng)用做出了貢獻(xiàn)。

2.3 CRISPR/Cas9技術(shù)在微藻中的應(yīng)用

首次應(yīng)用CRISPR/Cas9對(duì)微藻的研究中，Jiang等[31]將Cas9蛋白和sgRNA(simple guide RNA，sgRNA)基因通過電穿孔導(dǎo)入衣藻細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，用非同源末端連接系統(tǒng)修復(fù)雙鏈斷裂，采用CRISPR/Cas9對(duì)微藻中的4個(gè)靶基因進(jìn)行插入和缺失，成功在萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii) 細(xì)胞中表達(dá)Cas9蛋白與sgRNA，突變頻率達(dá)42.8%。然而，由于Cas9的毒性，未能獲得任何穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，嚴(yán)重降低了成功率。隨后有研究表明，通過運(yùn)送包含Cas9蛋白和sgRNAs的Cas9核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNPs)解決了這個(gè)問題，以避免與載體驅(qū)動(dòng)的Cas9表達(dá)相關(guān)的細(xì)胞毒性和脫靶問題。在MAA7、CpSRP43和ChlM這3個(gè)位點(diǎn)獲得了CRISPR/Cas9誘導(dǎo)的突變，與首次報(bào)道的轉(zhuǎn)基因Cas9誘導(dǎo)突變相比，靶向誘變效率提高了100倍，通過使用Cas9 RNPs大大提高了基因敲除效率[32]。

Wang等[33]以硝酸還原酶(nitrate reductase, NR)為例，在工業(yè)產(chǎn)油性海洋微綠球藻(Nannochloropsisspp.)中建立了一種精確基因組編輯方法，用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了微藻的1個(gè)硝酸還原酶基因，發(fā)現(xiàn)5 bp缺失突變體的比例超過1%，分離的突變體在NH4Cl作用下能正常生長(zhǎng)，但在NaNO3作用下不能正常生長(zhǎng)，是一個(gè)很有價(jià)值的轉(zhuǎn)NR基因的基礎(chǔ)菌株。有研究報(bào)道了在海洋微綠球藻中用CRISPR-Cas介導(dǎo)的基因組編輯的另一種方法：將RNP和編輯模板通過電穿孔直接導(dǎo)入微藻細(xì)胞，使Cas的表達(dá)可有可無，同源定向修復(fù)成為可能。Cas/RNPs與dsDNA修復(fù)模板的共導(dǎo)入有效地提高了靶位點(diǎn)的同源同組，產(chǎn)生了約70%的陽性突變系，陽性突變株比例顯著提高，有利于高效產(chǎn)生微綠球藻靶向突變體[34]。

海洋硅藻是真核微藻，在海洋中具有重要的生態(tài)作用，所以更需要建立簡(jiǎn)單的CRISPR/Cas9體系。Nymark等[35]在三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)中開發(fā)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，經(jīng)優(yōu)化后實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的靶基因敲除。該系統(tǒng)發(fā)揮功能需要的2個(gè)組分，Cas9核酸酶和引導(dǎo)核酸酶指向特定DNA序列的引導(dǎo)RNA，都可以在同一載體中表達(dá)，結(jié)果在26個(gè)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中有8個(gè)得到了突變子，突變頻率為31%。Moosburner等[36]提出了改進(jìn)方法，改進(jìn)后單基因和雙基因突變細(xì)胞系都是通過將1個(gè)選擇性Cas9和1個(gè)或2個(gè)sgRNAs接合后引入硅藻，同時(shí)利用陰性和陽性選擇的外顯子克隆策略，再利用人工測(cè)序、潮汐測(cè)序分析和T7核酸內(nèi)切酶分析，開發(fā)了細(xì)胞系篩選和基因分型策略，縮短產(chǎn)生突變體所需時(shí)間，結(jié)果單基因和雙基因敲除細(xì)胞系的突變率分別為48%和25%。

從微藻提煉油脂是解決石油枯竭和二氧化碳排放問題的一種可選擇、可持續(xù)、有前途的發(fā)展趨勢(shì)。鑒于微藻細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂含量的限制，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行改造具有重要意義。Lin等[37]證明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的質(zhì)粒適合對(duì)小球藻(Chlorellavulgaris)進(jìn)行基因插入，并以ω-3脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase 3，F(xiàn)ad3)基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建了結(jié)構(gòu)類似的含有Cas9片段的質(zhì)粒，該片段含有設(shè)計(jì)在Fad3基因上的sgRNA，在小球藻FSP-E中表達(dá)脂質(zhì)含量高達(dá)46%，這是首次成功將CRISPR/Cas9技術(shù)用于小球藻基因操作的案例。

本課題組目前正在進(jìn)行微藻的相關(guān)研究，獲得了帶有 G418 抗性的Cas9質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到小球藻，為CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于小球藻提供參考[38]。

3 展望

ZFN和TALEN都是蛋白識(shí)別機(jī)制，CRISPR/Cas9系統(tǒng)識(shí)別機(jī)制則是通過人工設(shè)計(jì)的sgRNA實(shí)現(xiàn)，操作簡(jiǎn)便，便于上手，容易構(gòu)建。此外，CRISPR/Cas基因組編輯的效率和精確度通過不斷的努力得到了提高，包括Cas蛋白和sgRNA的不同表達(dá)策略，因而成為了主流的基因組編輯技術(shù)。

目前，基因組編輯技術(shù)主要是產(chǎn)生內(nèi)源基因功能缺失的突變體，對(duì)基因定點(diǎn)替換及基因的定點(diǎn)插入仍具有極大的挑戰(zhàn)性，無法做到對(duì)任一位點(diǎn)上高效地替換或插入任意序列，這就限制了基因組編輯技術(shù)在微藻中的應(yīng)用。與此同時(shí)，微藻本身還有很多問題，由于它們獨(dú)特的細(xì)胞壁和表面結(jié)構(gòu)，很難將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，通常需去除細(xì)胞壁并使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，從而提高轉(zhuǎn)化效率。微藻可能在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)引入的遺傳物質(zhì)(包括DNA和RNA)具有沉默機(jī)制，暫時(shí)抑制其中一個(gè)沉默組件可以提高其轉(zhuǎn)化效率。

隨著基因工程技術(shù)、生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，微藻遺傳背景日趨明晰，對(duì)微藻進(jìn)行基因改造已成為現(xiàn)實(shí)。新型基因編輯技術(shù)僅在萊茵衣藻、三角褐指藻、海洋微綠球藻等幾種微藻模型中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，通過基因組、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法對(duì)某些潛在菌株進(jìn)行全面分析,深入研究將充分發(fā)揮新型基因編輯技術(shù)在更多微藻中的應(yīng)用潛力，以更有效和更可行的方式從微藻中生產(chǎn)生物燃料或其他有價(jià)值的產(chǎn)品，有可能徹底改變未來高效和精確的基因工程解決方案，具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)和發(fā)展前景。