王森,張卡,王泳浩,許雷

中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院, 北京 100081

在自然環(huán)境和日常生活中，各行各業(yè)的生產(chǎn)生活活動都會對河流湖泊等水體造成油污染。比如工業(yè)含油廢水和污水排放、屠宰場和榨油廠等產(chǎn)生的含油污水的排放，以及在食堂、酒店等日常生活場所中，食品加工食用時造成的水體污染?？偠灾祟惖亩鄶?shù)生產(chǎn)活動過程都可以成為環(huán)境水體油污染的來源。同時，據(jù)文獻報道，我國城市生活垃圾的構(gòu)成組分中，餐廚垃圾占到了約62%，而且這個比重仍然在以每年10%的幅度遞增，每年新增的餐廚垃圾產(chǎn)生量據(jù)統(tǒng)計可以達到500萬t[1]。隨著生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的變化，在餐廚垃圾排放總量每年遞增的同時，動植物油脂類物質(zhì)的比例也逐漸上升。據(jù)文獻報道,餐廚垃圾中粗脂肪的含量可以達29.07%以上。作為餐廚垃圾的重要成分，餐飲廢棄油脂具有成分復雜、難于降解的特點，成為一種高度污染源。如果不能對餐飲廢棄油脂進行正確的處理，會造成嚴重的環(huán)境污染和巨大的經(jīng)濟損失。

目前，油脂廢水處理方式主要分為物理分離、化學去除和生物降解。其中物理分離方法包括重力分離、粗?；蛛x、過濾分離和膜分離，分離過程中需要借助包括隔油池、去油罐、粗?；?、油水分離器、氣體浮選器等一系列特殊設(shè)備，分離效率較低?；瘜W去除法包括化學破乳和化學氧化，分離過程中需要消耗氯氣、氧氣、臭氧、雙氧水、高錳酸鉀以及Fenton 試劑等氧化劑，分離成本相對較高。生物降解的具體處理方法包括利用好氧活性污泥、接觸氧化、以及厭氧氧化池塘等[2]。相對于其他方法，生物降解法具有高效、低成本、條件溫和、無二次污染的特點，同時還能實現(xiàn)對廢棄油脂的能源利用，具有良好的研究潛能和應(yīng)用前景[1]。

到目前為止，國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)了許多具有油脂降解能力的菌株，其合成的降解酶一般為誘導酶類，降解基因由質(zhì)?？刂疲谔?、氮源受限的情況下才會表達合成[3]。因此，如何篩選培養(yǎng)高效油脂降解菌株并獲得關(guān)鍵酶基因就成為解決油脂污染的關(guān)鍵。早期研究分別從餐飲下水道和植物油精煉工廠污水排放點的污染土中馴化分離得到了具有油脂降解能力的細菌、霉菌和酵母菌，包含多薩假單胞菌、假產(chǎn)堿假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、栗褐芽胞桿等[4-6]。但已有的研究中，以橄欖油為唯一碳源的菌株的篩選和研究工作開展得較少。因此，本實驗的主要內(nèi)容和目的是分離篩選得到一株具有橄欖油降解能力的菌株，并通過對菌株降解特性的測定了解和驗證菌株的降解能力，以期為解決水體環(huán)境中的油脂污染提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 正己烷(色譜純)、橄欖油(分析純)、乙腈(色譜純)、異丙醇(色譜純)均購自Sigma公司。

用于篩選分離降解菌株的土樣采自山西省左權(quán)縣某屠宰場的污水排放口附近的地表污染土，采樣時采用對角線采樣法。

1.1.2培養(yǎng)基 馴化培養(yǎng)基：(NH4)2SO41 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，NaH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.25 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，CaCl2，0.01 g·L-1，121 ℃高壓滅菌 20 min。

篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO41 g·L-1，K2HPO40.5 g·L-1，NaH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.25 g·L-1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001 g·L-1，CaCl20.01 g·L-1，瓊脂15 g·L-1，121 ℃高壓滅菌20 min。冷卻前加入滅菌的橄欖油10 mL·L-1，配置好的聚乙二醇溶液終濃度1 g·L-1作為乳化劑，混合均勻后制成固體平板備用。

LB 培養(yǎng)基配方：蛋白胨10 g·L-1，酵母粉 5 g·L-1，NaCl 10 g·L-1。制平板時(LB固體培養(yǎng)基)加入15 g·L-1瓊脂。

1.2 方法

1.2.1油脂降解菌的分離純化 梯度馴化法菌株篩選：稱取約5 g污染土土樣與100 mL馴化培養(yǎng)基混合均勻，配制于 250 mL錐形瓶中，30 ℃震蕩培養(yǎng)7 d。第一次培養(yǎng)結(jié)束后，靜置取上清約 5 mL加入到新的馴化培養(yǎng)基中，同時移液槍加入500 μL橄欖油[4], 30 ℃震蕩培養(yǎng)7 d。使用含橄欖油的馴化培養(yǎng)基篩選菌株，并在馴化過程中每次增加橄欖油濃度，從500 μL·L-1橄欖油濃度最終提高到100 mL·L-1。

菌株初篩：通過梯度馴化篩選得到的菌株，菌液經(jīng)10×、100×、1 000×梯度稀釋后分別涂布于篩選培養(yǎng)基平板，放置于30 ℃培養(yǎng)箱后定期觀察，出現(xiàn)降解圈后在LB平板上劃線分離純化菌株。

菌株復篩：將初篩培養(yǎng)基平板上所有出現(xiàn)降解圈現(xiàn)象且彼此形態(tài)有明顯差別的菌株挑出，用含有100 mL·L-1橄欖油的馴化培養(yǎng)基再次篩選培養(yǎng)。以未加入菌株的馴化培養(yǎng)基作為空白對照，通過橄欖油比色法，使用紫外分光光度儀測定獲得的降解菌株24 h后的橄欖油降解率。挑選降解率較高的菌株在LB 平板上再次劃線分離出單菌落，4 ℃保存待用。

1.2.2菌株的鑒定 通過電子顯微鏡觀察菌株的形態(tài)特征并使用Biolog試劑盒測定菌株的生理生化指標。通過聚合酶鏈式反應(yīng)擴增得到實驗菌株16S rDNA后，進行測序分析，測序結(jié)果使用Blast在Genbank中比對分析，最終通過使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定實驗菌株所屬的菌屬。其中，PCR擴增用到的通用引物分別為：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。

1.2.3生長曲線的測定 將實驗菌株分別接種于含有100 mL·L-1橄欖油的馴化培養(yǎng)基中，30 ℃環(huán)境中160 r·min-1的搖床上震蕩培養(yǎng)，紫外可見分光光度計測定48 h內(nèi)培養(yǎng)基中菌液濃度，繪制生長曲線。

1.2.4培養(yǎng)基中橄欖油濃度測定 將配置好的馴化培養(yǎng)基分裝至若干個50 mL錐形瓶中，每瓶加入培養(yǎng)基20 mL，橄欖油100 mL·L-1，并以1%的濃度接入實驗菌株后，分為14組。每組添加未接菌的含橄欖油的馴化培養(yǎng)基作為空白對照，將菌液置于30 ℃環(huán)境中震蕩培養(yǎng)。間隔6 h分別對橄欖油濃度進行檢測，計算菌株降解率。液相色譜檢測條件為：色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流動相∶乙腈∶異丙醇(體積比)= 1∶1，上樣量：5 μL，流速 0.8 mL·min-1，柱溫30 ℃，極管陣列復合波長檢測器進行檢測，檢測波長為290 nm[7-8]。

1.2.5外界環(huán)境對油脂降解的影響 當實驗菌株生長至對數(shù)增長期時(OD600≈1.5)離心收集菌體，按5% 的接種量接種于橄欖油濃度為100 mL·L-1的馴化培養(yǎng)基中，分別測定不同生長環(huán)境中菌株的降解率。其中，pH的測定范圍為5.5～10，溫度的測定范圍為10～50 ℃，培養(yǎng)基最高鹽濃度為12%，并通過測定油脂的殘余濃度計算菌株的降解率。

1.2.6菌株對不同底物的降解能力 配置好的馴化培養(yǎng)基分裝至若干個50 mL錐形瓶中，每瓶加入培養(yǎng)基20 mL，并以1%的濃度接入實驗菌株后，分為4組，分別用于測定實驗菌株對大豆油、花生油、芝麻油和豬油的降解效率。每組均以80 mL·L-1的終濃度加入油脂后，加入1 g·L-1的聚乙二烯作為乳化劑， 在菌株最適條件下(35 ℃，pH 8)震蕩培養(yǎng)72 h。使用等體積正己烷抽提油脂，液相色譜測定剩余量并計算各組降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗菌株的鑒定

2.1.1菌落形態(tài)和生理生化特征 由于篩選培養(yǎng)基由橄欖油通過聚乙二醇乳化后制備而成，倒板后呈白色霧狀，故降解菌在培養(yǎng)基長出后周圍出現(xiàn)透明狀降解圈，菌落生長形態(tài)特征為圓形、乳白色、表面平滑，并可判定為革蘭氏陰性細菌。通過Biolog試劑盒對實驗菌株的生理生化特征進行鑒定(表1)，最終顯示實驗菌株屬于無色桿菌屬(Achromobacter)。

表1 實驗菌株的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of experimental strains

2.1.2菌株16S rDNA 序列測定 實驗菌株的16S rDNA 基因序列測序結(jié)果在NCBI上比對分析后，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，實驗菌株與Achromobacterpulmonis聚為一支，Biolog試驗分析和16S rDNA基因測序比對結(jié)果基本一致，可以證實實驗菌株為無色桿菌(Achromobactersp.)。

2.2 菌株降解率測定

2.2.1實驗菌的生長曲線 如圖2所示，實驗菌株在含有橄欖油的無機鹽培養(yǎng)基中，約18 h進入對數(shù)生長期直至30 h進入平臺期，最大OD600值約為2.1左右。由此可以看出，由于油脂類物質(zhì)的分子量較大，分解轉(zhuǎn)化速率較低，作為唯一碳源時減緩菌株前期增殖。當有一定量油脂降解產(chǎn)物生成后，菌株增殖速率迅速增長，因此當考慮優(yōu)化培養(yǎng)基時，可以添加少量其他碳源。

2.2.2菌株降解性能測定 通過建立好的液相色譜檢測方法測定實驗菌株對橄欖油的降解能力，計算與對照相比橄欖油的濃度變化來表示降解率，進而繪制降解曲線。從圖3中可以看出，30 h前降解率增長較為緩慢，30 h左右之后先快速升高，之后趨于平緩，拐點出現(xiàn)在54 h左右，最大降解率約89%。

圖1 基于16S rRNA基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences and related stains

圖2 菌株以橄欖油為單一碳源的生長曲線Fig.2 Growth curve with olive oil as only carbon source

圖3 菌株發(fā)酵過程中橄欖油降解率Fig.3 Degradation rate of condensed tannin during fermentation

2.3 環(huán)境因素對降解能力的影響

2.3.1pH對菌株降解的影響 前期實驗配置的含橄欖油培養(yǎng)基自然pH通常為7.5左右，從圖4可以看出，在pH 7.5左右，橄欖油降解率可以達到90%以上，在pH 7～9范圍內(nèi)，菌株對油脂的降解率可以保持較高值，可達到75%以上。當pH低于6.5時，降解率明顯下降，可能是由于油脂降解產(chǎn)生脂肪酸等降解產(chǎn)物，若生長環(huán)境偏酸性，不利于菌株對脂肪酸的吸收降解。從總體趨勢上看，明顯可以看出降解菌株對堿性環(huán)境的耐受性高于偏酸性環(huán)境，這可能也與油脂降解產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物有關(guān)。

圖4 不同pH條件下菌株對橄欖油的降解率Fig.4 Degradation rate of olive oil by strains under different pH conditions

2.3.2溫度對菌株降解的影響 從圖5中可以看出，培養(yǎng)溫度在35 ℃時，降解率達到92%，溫度過高或過低均不利于菌株生長，實驗證明，當溫度低于15 ℃時，環(huán)境因素阻礙菌株正常生長，當溫度高于45 ℃時，菌株也出現(xiàn)生長緩慢的現(xiàn)象。在菌株正常生長的溫度范圍內(nèi)，油脂作為單一碳源的培養(yǎng)基中，降解橄欖油的最適溫度為35 ℃左右。該溫度和菌種來源地環(huán)境溫度以及篩選培養(yǎng)溫度(30 ℃)相比較高，可能是由于相對高溫有利于油脂的相變和乳化，從而促進菌株對橄欖油的吸收降解。

圖5 不同溫度下菌株對橄欖油的降解率Fig.5 Degradation rate of olive oil by strains at different temperatures

2.3.3鹽濃度對菌株降解的影響 從圖6可以看出，隨著鹽濃度升高，菌株對橄欖油的降解率逐漸下降，鹽濃度在6%以下時，菌株對橄欖油的降解率可以保持在70%以上。當鹽濃度高于6%菌株降解率明顯下降，可能是高鹽濃度環(huán)境中，菌株無法正常生長，同時，高滲透壓又影響菌株對油脂類物質(zhì)的吸收，從而急劇降低降解率。

2.4 菌株對不同底物的降解能力

圖7是實驗菌株對大豆油、花生油、芝麻油、豬油等不同食用油的降解情況，從圖7中可以看出菌株對不同種類油脂的降解效率略有不同，這可能是由于不同油脂的成分和結(jié)構(gòu)特點決定的。其中，豬油作為一種動物油脂，甘油三酯和游離脂肪酸中飽和脂肪酸含量較高，達到43%左右，在常溫下一般以固態(tài)存在，對菌株的降解具有顯著影響?；ㄉ统煞窒鄬^為復雜，有報道表明其中含有40種有機酸、6種酮類、7種醇類及脂類，另外氨基酸及其衍生物9種，糖類及其衍生物5種，以及其他化合物總計90余種，由于復雜的化學組成，影響了菌株的降解效率，使得最終降解率有所下降，但可能由于成分中的小分子化合物含量相對較高，降解初期菌株生長速率和降解率相對其他種類油脂較高。大豆油與芝麻油的成分相似，各組分的含量有細微差別，其中芝麻油中不飽和脂肪酸含量相對較高,使得降解率有所差異，總體上看，實驗菌株對不同種類油脂均保有較高的降解效率。

3 討論

動植物油脂作為一種生物體的儲能物質(zhì)，可以在體內(nèi)徹底氧化。但如果要作為機體的唯一碳源，需要其能夠轉(zhuǎn)化為糖類和氨基酸等其他必需生物大分子。本實驗首先采集了屠宰場中長期受到動物油脂污染的土壤作為供菌源，隨后通過富集培養(yǎng)、篩選分離得到了能夠?qū)㈤蠙煊妥鳛槲ㄒ惶荚吹膶嶒灳辏谔峁o機氮作為氮源的培養(yǎng)基中生長。隨后在此環(huán)境中測定了實驗菌株的生長曲線，通過對實驗菌株的生理生化鑒定結(jié)果和16S RNA 序列比對結(jié)果分析，確定該菌株屬于無色桿菌屬(Achromobactersp.)。

圖6 不同培養(yǎng)基鹽濃度條件下菌株對橄欖油降解率Fig.6 Degradation rate of olive oil by strains under different medium salt concentration

圖7 實驗菌株對不同種類油脂的降解情況Fig.7 Degradation of different kinds of oil by experimental strains

本實驗對篩選分離得到的實驗菌株的降解特性進行測定。實驗結(jié)果表明，實驗菌株降解油脂的最適pH條件為7.5、pH 7～9范圍內(nèi)菌株均能正常生長，并保持較高的降解率。實驗菌株最適溫度條件為35 ℃。在最適條件下，實驗菌株接種后4～5 d降解率可以達到90%，同時，該菌株能夠在鹽濃度低于40 g·L-1環(huán)境中保持較高的降解率，實驗表明，由于不同種油脂的成分和化學結(jié)構(gòu)的差異，實驗菌株的降解效率各有不同，從總體上看，實驗菌株對不同種類油脂均保有較高的降解效率，表明實驗菌株具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力和環(huán)境修復潛力。

相較于霉菌和酵母菌，細菌更易于實驗操作和研究[9-10]。獲得高效的有機物降解菌，是生物修復首先要解決的關(guān)鍵問題，對于菌株降解油脂的通路和關(guān)鍵酶已有研究報道，關(guān)鍵酶是乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶，只有將脂肪酸分解產(chǎn)物乙酰輔酶A通過該通路轉(zhuǎn)化為琥珀酸才能合成單糖直接供能，從而將油脂作為唯一碳源進行生長[11]。因此，通過同源克隆獲得關(guān)鍵酶異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合酶基因?qū)⑹菢?gòu)建油脂降解工程菌株的關(guān)鍵[5]。這株實驗菌不僅在解決水體環(huán)境污染和廢棄物能源再利用方面具有重要經(jīng)濟價值，而且為構(gòu)建多功能降解菌株提供了技術(shù)支持。