胡穎嵩，衛(wèi) 明，唐 晶，葉 巍，楊 楷

(湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430015)

肺炎克雷伯菌具有多重耐藥性，可以產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)超光譜β內(nèi)酰胺酶，對(duì)于頭孢菌素等多種抗菌藥物均會(huì)產(chǎn)生耐藥，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)了對(duì)亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌，因此對(duì)肺炎患者的治療產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，目前認(rèn)為引發(fā)耐藥主要是孔蛋白確實(shí)導(dǎo)致了外模滲透性發(fā)生改變，同時(shí)形成了水解亞胺培南β內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變[1]。近年來(lái)隨著基因?qū)W的飛速發(fā)展通過(guò)對(duì)耐藥菌株進(jìn)行分析了解耐藥過(guò)程中的變化已成為臨床熱點(diǎn)，目前認(rèn)為耐藥的重要機(jī)制是膜蛋白缺失，ompK35是細(xì)菌耐藥主要膜蛋白，AmpC則是腸桿菌或者綠膿假單胞菌染色體或者質(zhì)粒介導(dǎo)形成的β內(nèi)酰胺酶，可以被誘導(dǎo)形成對(duì)β-內(nèi)酰胺抗菌素抑制劑不敏感，但是兩者具體的作用機(jī)制臨床說(shuō)法不一[2]。為了進(jìn)一步深入分析AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中情況，本研究進(jìn)行了觀察，以期為臨床提供指導(dǎo)和依據(jù)，現(xiàn)匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)菌株來(lái)源：2015年1月至2020年1月，收集我院分離培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌200株，其中耐亞胺培南菌株50株(A組)，不耐亞胺培南菌株150株(B組)。

1.2試劑及儀器：全自動(dòng)鑒定系統(tǒng)：美國(guó)BD公司Phoenix 100；高速低溫離心機(jī)：安徽中科中佳公司 HC 3018R；PCR擴(kuò)增儀：德國(guó)Biometra公司；自動(dòng)型DNA序列分析儀：美國(guó)ABI公司3730型；臺(tái)式高速低溫離心機(jī)：德國(guó) Eppendorf公司5417R；恒溫水浴箱：廣州明珠電器廠；比濁儀：法國(guó)生物梅里埃公司；藥敏紙片：OXOID公司；亞胺培南：深圳市海濱制藥有限公司。

1.3試驗(yàn)方法：采用CLSI紙片擴(kuò)散法開展菌株藥敏試驗(yàn)，選擇純培養(yǎng)菌落接種肉湯培養(yǎng)基，使用無(wú)菌棉蘸取菌液布滿瓊脂表面，室溫下干燥5min后使用無(wú)菌鑷子將含藥紙片平鋪在瓊脂表面。溫箱中孵育，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。使用瓊脂稀釋法測(cè)定次抑菌濃度IMP菌株對(duì)耐藥IMP的最低抑菌濃度(MIC)值。IMP的MIC判斷標(biāo)準(zhǔn)：MIC低于4ug/mL判斷為敏感，MIC=8ug/mL判斷為中介，MIC超過(guò)16ug/mL判斷為耐藥。三維水解實(shí)驗(yàn)檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶：經(jīng)高壓滅菌棉簽從培育好的菌懸液中沾取0.5麥?zhǔn)蠁挝环窝卓死撞鷳乙?，均勻涂抹在M-H瓊脂平板上，孵育培養(yǎng)24h矢狀菌苔生長(zhǎng)方向都指向紙片為陽(yáng)性。提取肺炎克雷伯菌基因組DNA：選擇分離培養(yǎng)菌體2g置于LB培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18h，離心后加入GN結(jié)合液混合均勻靜置5min，再次離心后漂洗30s，清洗3次去除離心純化柱殘留漂洗液，純化柱套入干凈1.5mL離心管加入100ul緩沖液心1min，收集液體是洗脫下來(lái)的基因組DNA，加入ompK35引物：FOR GCGCATCTCCAAGACCATG REV GCCACGCGATTTGACGGAG進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物5ul，加上樣緩沖液1ul，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳30min在紫外成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1A組和B組AmpC基因和蛋白表達(dá)比較：A組AmpC基因、蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于B組(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 A組和B組AmpC基因和蛋白表達(dá)比較

2.2A組和B組ompK35基因和蛋白表達(dá)比較：A組ompK35基因、蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組(P<0.05)，見表2和圖1。

表2 A組和B組ompK35基因和蛋白表達(dá)比較

圖1 Western blot檢測(cè)圖

2.3相關(guān)性分析：AmpC基因與ompK35基因呈負(fù)相關(guān)(r=-0.329，P<0.05)；AmpC蛋白與ompK35蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.435，P<0.05)。見圖2。

圖2 相關(guān)分析圖

3 討 論

肺炎克雷伯菌屬于腸桿菌科革蘭氏陰性菌，也是引發(fā)肺炎重要的致病菌，會(huì)導(dǎo)致肺部感染形成高熱狀態(tài)，在老年人群、長(zhǎng)期飲酒和營(yíng)養(yǎng)不良人群中極易感染，研究還發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期住院尤其是出現(xiàn)臟器功能衰竭患者容易感染肺炎克雷伯菌，增加了臨床治療難度，患者病死率升高[3,4]。隨著現(xiàn)代臨床應(yīng)用抗菌藥物越來(lái)越廣泛，肺炎克雷伯菌對(duì)于第三代頭孢菌素耐藥率接近三分之一，國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)其導(dǎo)致呼吸道感染顯著升高[5,6]。目前研究發(fā)現(xiàn)由多藥耐藥病原菌導(dǎo)致肺部感染最佳治療方案尚未明確，需要進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，而對(duì)于耐藥病菌特效治療方案較少，提示臨床可用有效治療方法不多[7]。β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物屬于常見的抗生素，治療細(xì)菌感染效果顯著，但是耐藥性報(bào)道也越來(lái)越常見，耐藥性出現(xiàn)多源化與多樣化，目前認(rèn)為β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌發(fā)送耐藥的主要機(jī)制可以水解β-內(nèi)酰胺類抗生素β-內(nèi)酰胺環(huán)造成活性喪失繼而導(dǎo)致耐藥[8]。目前大量的研究證實(shí)了AmpC酶表達(dá)是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酞胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性主要原因，同時(shí)膜蛋白缺失也是重要機(jī)制，ompK35則是肺炎克雷伯菌細(xì)菌耐藥主要膜蛋白[9]。

本研究分析了AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中的情況，通過(guò)分離耐藥菌株后進(jìn)行試驗(yàn)了解肺炎克雷伯均對(duì)于亞胺培南耐藥特點(diǎn)。AmpC酶為頭孢菌素酶，分子結(jié)構(gòu)屬于C類，和超廣譜β內(nèi)酰胺酶不同，優(yōu)選底物屬于頭孢菌素，對(duì)頭霉烯類抗菌藥物具有高水平耐藥性，而且金屬酶類可以產(chǎn)生多重耐藥，只對(duì)單環(huán)類抗菌藥物形成敏感性，其可以水解大部分β內(nèi)酰胺類抗菌藥物[10]。研究顯示由質(zhì)粒介導(dǎo)AmpC酶可以在外膜蛋白缺失狀態(tài)下依然引發(fā)細(xì)菌對(duì)于亞胺培南耐藥，主要是其可以進(jìn)行水解，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶ACT-1能夠在一株產(chǎn)氣腸桿菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)CMY-10，均具有水解碳霉烯類藥物的特點(diǎn)[11]。膜蛋白o(hù)mpK35是亞胺培南進(jìn)入菌體的主要通道，研究發(fā)現(xiàn)ompK35基因減少同耐亞胺培南肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥有關(guān)，發(fā)揮耐藥作用主要是表達(dá)量的減少，而且不管AmpC酶表達(dá)量超過(guò)或低于正常只要同時(shí)存在ompK35基因表達(dá)異常均會(huì)導(dǎo)致肺炎克雷伯菌株對(duì)亞胺培南耐藥[12,13]。還有研究發(fā)現(xiàn)疏水性和帶負(fù)電荷越多抗菌藥物分子、較大藥物分子均不容易通過(guò)，而外膜蛋白缺失會(huì)造成抗菌藥物、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程異常，造成了藥物通透性降低，而且通過(guò)傳代后膜蛋白可以逐漸恢復(fù)，膜蛋白恢復(fù)對(duì)亞胺培南滲透性增加導(dǎo)致了敏感性可以得到恢復(fù)[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，A組AmpC基因、蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于B組，提示了耐亞胺培南肺炎克雷伯菌AmpC表達(dá)顯著升高。A組ompK35基因、蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于B組，提示了耐亞胺培南肺炎克雷伯菌ompK35基因和蛋白表達(dá)量明顯降低。通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)AmpC基因與ompK35基因呈負(fù)相關(guān)；AmpC蛋白與ompK35蛋白呈負(fù)相關(guān)。本研究通過(guò)分析了AmpC、ompK35在亞胺培南誘導(dǎo)肺炎克雷伯菌耐藥中的變化，證實(shí)了AmpC酶是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥的重要因素，ompK35基因明顯降低同樣是導(dǎo)致肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥的重要因素，而且兩者具有相關(guān)性，為臨床了解亞胺培南導(dǎo)致肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制提供了相應(yīng)的依據(jù)，但是本研究對(duì)于具體機(jī)制以及兩種基因之間是否存在相互影響未能深入研究，還需擴(kuò)大樣本量、長(zhǎng)期隨訪論證。

綜上述所，耐亞胺培南肺炎克雷伯菌AmpC表達(dá)量升高，ompK35表達(dá)量降低，兩者可能在耐藥機(jī)制中有重要作用。