劉亞琪,鄭承紅

(1.湖北省襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，湖北 襄陽(yáng) 441000 2.湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430065)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是僅次于胃癌和食道惡性腫瘤的第三大惡性腫瘤，男性發(fā)生率高于女性，約為 3∶1 。我國(guó) HCC 患者年齡在 45～65 歲之間，但近年來(lái)年輕患者的發(fā)病率顯著增加[1]。HCC治療方式主要為手術(shù)，放射和化療，且預(yù)后與臨床和病理類型相關(guān)。HCC早期癥狀不明顯，且多數(shù)患者由于晚期癌細(xì)胞分化率低，治愈率仍然較低[1]。因此，開發(fā)生物標(biāo)志物用于肝癌的早期發(fā)現(xiàn)，診斷和治療是當(dāng)務(wù)之急。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA, miRNA)通過(guò)影響靶基因的表達(dá)可在癌癥的發(fā)展中產(chǎn)生重要調(diào)控作用。研究表明miR-193a 在多種人類癌癥中發(fā)揮抗癌作用，可以通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)展[2]。此外，miR-193a抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲[3]。但是到目前為止，miR-193a在HCC中的具體作用尚不清楚。已發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中，Wilms'腫瘤1(WT1)具有診斷和預(yù)后作用，且WT1的高表達(dá)與卵巢癌的侵襲性臨床特征有關(guān)[4]。此外，在人乳腺癌中和類膠質(zhì)瘤中證實(shí)WT1的異常表達(dá)[5,6]。但是，尚未在HCC中研究miR-193a與WT1之間的相互作用。因此本研究擬探討，MicroRNA-193a通過(guò)靶向WT1抑制肝細(xì)胞癌的發(fā)生及對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1臨床組織標(biāo)本和患者基本資料:實(shí)驗(yàn)組織取自武漢市中醫(yī)醫(yī)院的75名HCC接受手術(shù)的患者。收集患者年齡、性別、腫瘤分期、是否轉(zhuǎn)移、分化程度等資料。所有HCC患者在手術(shù)前均未接受任何治療，術(shù)中收集肝癌組織和癌旁非癌的正常組織，并將它們冷凍在液氮中，然后保存在-80℃的冰箱中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所有參加本研究的患者均簽署了知情同意書，該研究獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和miR-193a mimic以及inhibitor轉(zhuǎn)染:正常人肝細(xì)胞系 LO2和肝癌細(xì)胞系 MH-CC97H，HCCLM3， Huh7 HCC 細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。將細(xì)胞系接種在含10%胎牛血清的 Dulbeco改良 eagle’s 培養(yǎng)基中(Gibco，美國(guó))，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。從RiboBio公司(廣州，中國(guó))獲得miR-193a mimic或inhibitor，以及它們的對(duì)照組(NC)。 根據(jù)試劑盒說(shuō)明， 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen, 美國(guó))將它們分別轉(zhuǎn)移到 HCCLM3 細(xì)胞中。

1.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR):根據(jù)試劑盒說(shuō)明，使用TRIzol試劑(Promega，美國(guó))提取肝癌組織總RNA，并使用cDNA合成試劑盒(TIANGEN，中國(guó))合成cDNA。應(yīng)用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美國(guó))以及ABI 7300 序列檢測(cè)系統(tǒng)( Thermo Fisher Scientific，美國(guó))上進(jìn)行 qRT-PCR。以U6 和GAPDH分別用作 miR-193a 和WT1 的內(nèi)參對(duì)照。使用 2-ΔΔct方法計(jì)算CT值。qRT-PCR引物的設(shè)計(jì)如下：miR-193a,正向：5′-TGGGTCTTTGCGGGCGAGATGA-3′,反向ACCCAGAAACGCCCGCTCTACT-3′；U6,正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向：5'-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3'； WT1，正向：5'-CAGGCTGCAATAAGAGATATTTTAAGCT-3'，反向：5'-GAAGTCACACTGGTATGGTTTCTCA-3'；GAPDH， 正向：5'-TGCACCACCAACTGC TTAGC-3'，反向：5'-GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG-3'。

1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)(CCK-8)試驗(yàn):采用CCK-8試劑盒測(cè)定miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力的變化。將 3×104HCCLM3 細(xì)胞鋪板在96孔板中并孵育0、24、48和72h。然后將細(xì)胞放置在帶5%CO2，37℃的保溫箱。取10 μLCCK-8試劑(Dojindo Molecular Technologies，日本)添加到每個(gè)孔中處理 2h，使用酶標(biāo)儀在 450 nm 的吸光度下檢測(cè)。

1.5異種移植腫瘤形成試驗(yàn):裸鼠(6周)購(gòu)自南京大學(xué)(中國(guó)南京)的模型動(dòng)物研究中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。將帶有miR-193a質(zhì)?；蜿幮詫?duì)照的4×106HCCLM3細(xì)胞將其注射到裸鼠的左上側(cè)，每4天觀察一次腫瘤體積。4周后處死小鼠對(duì)腫瘤進(jìn)行稱重。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):將野生的或突變的WT1的3'-UTR插入pmirGLO熒光素酶載體(Promega，美國(guó))，用于熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定。之后，將具有WT1的3'-UTR和miR-193a模擬物的載體轉(zhuǎn)染到HCCLM3細(xì)胞中。最后，使用雙重?zé)晒馑孛笢y(cè)定系統(tǒng)(Promega，美國(guó))來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-193a在肝癌組織中表達(dá)下降:與相鄰的非癌組織相比，HCC組織中的miR-193a表達(dá)降低(圖1A)(P<0.01)，且WT1 mRNA在HCC組織中顯著高于正常組織(圖1B)(P<0.01)，進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-193a與WT1 mRNA呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.454,P<0.001)(圖1C)。此外，miR-193a表達(dá)異常與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)和TNM分期(P=0.004)有關(guān)(表1)，提示miR-193a的異常表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。miR-193a和WT1的異常表達(dá)還與HCC患者的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的miR-193a在HCC患者中具有更長(zhǎng)的總生存期(P=0.029，圖1D)。

圖1 A.HCC組織和非癌組織miR-193a表達(dá)量 B.HCC組織和非癌組織中WT1 mRNA表達(dá)量比較 (**P<0.01) C.HCC組織中miR-193a 表達(dá)量與WT1 mRNA表達(dá)量的相關(guān)性 D.miR-193高表達(dá)和低表達(dá)患者HCC生存曲線分析

表1 miR-193a表達(dá)與HCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系

2.2miR-193a mimic和inhibitor對(duì)HCC增殖的影響:我們繼續(xù)檢測(cè)了 MHCC97H，HCCLM3，Huh7 和 LO2細(xì)胞系中 miR-193a的 表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與 LO2細(xì)胞相比，MHCC97H，HCCLM3 和 Huh7 細(xì)胞系中的 miR-193a 表達(dá)下調(diào)(圖 2A)。之后，將 miR-193a mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染到HCCLM3 細(xì)胞中。結(jié)果表明，miR-193a 表達(dá)通過(guò)其mimic增強(qiáng)， 并通過(guò)inhibitor降低(圖2B)。之后我們發(fā)現(xiàn) miR-193a mimic抑制了HCCLM3 細(xì)胞的細(xì)胞增殖(圖 2C)(*P<0.01)。相反miR-193a inhibitor促進(jìn)了HCCLM3細(xì)胞中的細(xì)胞增殖(圖2D)(*P<0.01)。

圖2 A.miR-193a表達(dá)量在正常肝細(xì)胞系(LO2)以及肝癌細(xì)胞系MHCC97H，HCCLM3，Huh7中的表達(dá)(**P<0.01 vs LO2 ;*P<0.05 vs LO2) B.miR-193a mimic 和miR-193a inhibitor 對(duì)miR-193a 的影響 C.miR-193a mimic對(duì) HCCLM3細(xì)胞增殖的影響 (**P<0.01 vs NC) D. miR-193a inhibitor對(duì) HCCLM3細(xì)胞增殖的影響(**P<0.01 vs NC)

2.3miR-193過(guò)表達(dá)抑制了裸鼠成瘤:我們將miR-193a轉(zhuǎn)染質(zhì)?；騧iR-NC注射到裸鼠中，在第4周發(fā)現(xiàn)注射miR-193a質(zhì)粒的裸鼠中HCC的腫瘤質(zhì)量顯著小于miR-NC(*P<0.05)(圖3A,B)。

2.4HCC中的miR-193a 直接靶向 WT1:此外，TargetScan (http://www.targetscan.org/) 數(shù)據(jù)庫(kù)表明 miR-193a 具有與 WT1 的 3'-UTR 的結(jié)合位點(diǎn)(圖 4A)。在熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)，miR-193a mimic降低了野生型WT1 的螢光素酶活性。但在具有 mut-WT1 和 miR-193a 模擬物的HC-CLM3 細(xì)胞中未觀察到熒光素酶活性的降低(圖 4B)，表明 miR-193a可直接靶向 WT1，并在 HCC 中對(duì)其表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。

圖3 A.miR-193a與miR-NC注射成瘤的大體情況B.miR-193a與miR-NC注射致成瘤重量的比較(*P>0.05)

圖4 A. miR-193a 具有與 WT1 的 3'-UTR 的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn) B. miR-193a模擬物降低了野生型WT1 的螢光素酶活性，但未降低WT1 Mut的活性

3 討 論

研究表明miRNA 在HCC中具有重要的分子功能和病理學(xué)意義。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多癌基因和抑癌基因的 miRNA 與 HCC 的腫瘤發(fā)生有關(guān)。例如，miR-199 通過(guò)下調(diào) HCC中 G 蛋白信號(hào)傳導(dǎo) 17 的調(diào)節(jié)因子而起抑制性 miRNA 的作用[7]。相反，miR-219-5p通過(guò)調(diào)節(jié)鈣黏著蛋白1促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本研究探討了miR-193a與HCC之間的關(guān)系。在HCC中發(fā)現(xiàn)miR-193a的下調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。此外，miR-193a的低表達(dá)預(yù)示了HCC患者的不良預(yù)后。在功能上，miR-193a的過(guò)表達(dá)在抑制了HCC細(xì)胞增殖。

目前已發(fā)現(xiàn)miR-193a在人類癌癥中異常表達(dá)，并可以作為對(duì)抗癌癥的重要武器[2]。例如在肺癌中檢測(cè)到miR-193a的下調(diào)，還發(fā)現(xiàn)miR-193a的下調(diào)與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理特征及預(yù)后不良有關(guān)[8]。此外，miR-193a通過(guò)抑制CCND1表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。此外，miR-193a還被發(fā)現(xiàn)是抑制結(jié)腸癌發(fā)生的關(guān)鍵基因[10]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)miR-193a直接靶向WT1，并在HCC中對(duì)其表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。WT1是促紅細(xì)胞生成素基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，可影響細(xì)胞生長(zhǎng)[11]。WT1在某些人類癌癥中的作用不同。此研究中，WT1起到對(duì)HCC起到了致癌作用。在HCC中發(fā)現(xiàn)了WT1的上調(diào)，并預(yù)示了肝癌患者的預(yù)后不良。此外，發(fā)現(xiàn)miR-193a通過(guò)靶向WT1抑制乳腺癌的發(fā)生[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)WT1被確定為幾個(gè)miRNA的直接下游目標(biāo)。例如，發(fā)現(xiàn)miR-15a和miR-16-1通過(guò)靶向白血病細(xì)胞中的WT1來(lái)抑制細(xì)胞增殖[12]。miR-590通過(guò)調(diào)節(jié)WT1表達(dá)抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖[12]。

總之，本研究結(jié)果表明miR-193a肝癌組織中的表達(dá)顯著低于相鄰的非癌正常組織，并與HCC患者的預(yù)后不良有關(guān)。此外，miR-193a 通過(guò)靶向 WT1來(lái)抑制 HCC 的腫瘤發(fā)生，這將有助于為HCC的診斷和治療提供新的方向。