錢曉慶 朱 萌 石鋼鵬 熊光權(quán) 石 柳 吳文錦 汪 蘭 汪訓(xùn)枝 丁安子

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430064；3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430064；4.陽新縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 黃石 435200)

鮰魚(Channelcatfish)學(xué)名長吻鮠，是中國名貴的淡水魚類，2018年產(chǎn)量為23.04萬t。鮰魚肉質(zhì)嫩滑不肥膩、味美不腥，且無肌間刺，深受消費者青睞。為保證較好的食用品質(zhì)，常采用冷藏、冰藏、微凍貯藏等方式對鮰魚進(jìn)行低溫貯運。貯運銷售過程中，常通過監(jiān)測鮰魚原料的新鮮度以確保其食用品質(zhì)處于較佳狀態(tài)。

鮰魚等水產(chǎn)品新鮮度評價指標(biāo)包括細(xì)菌總數(shù)[1]、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)[2]、2-硫代巴比妥酸值(TBARS)[3]和K值[4]，其中K值反映水產(chǎn)品中核苷酸分解產(chǎn)物含量變化[5]，最能體現(xiàn)水產(chǎn)品新鮮度變化[6]。付奧等[7]研究了冷藏條件下草魚三磷酸腺苷(ATP)關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量及K值的變化；戚曉玉等[8]研究了冰藏條件下日本沼蝦ATP降解產(chǎn)物的含量變化及其對鮮度的影響；張龍騰等[9]研究了微凍貯藏條件下鰱魚片品質(zhì)指標(biāo)、ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物及ATP關(guān)聯(lián)酶活性的變化規(guī)律。實際貯運中，鮰魚從產(chǎn)地→冷鏈物流→賣場→消費者，伴隨著長距離的運輸、環(huán)境溫度的變化等多種不確定因素，其貯運過程類似于凍融循環(huán)過程。目前有關(guān)凍融循環(huán)貯藏相關(guān)研究較少，且側(cè)重于對水產(chǎn)品肌肉品質(zhì)的影響研究[10-11]，對水產(chǎn)品新鮮度影響及預(yù)測研究尚未見報道。

近紅外光譜法是一種新興的光譜分析方法，利用有機(jī)物中含氫基團(tuán)(C—H、O—H、N—H等)的倍頻與合頻吸收，對特定化合物(如蛋白質(zhì)、水分等)實現(xiàn)快速、無損的定性/定量分析[12-15]。因此，近紅外光譜法在水產(chǎn)品新鮮度分析領(lǐng)域也得到廣泛研究，其對鯽魚[16]、鯉魚[17]、金槍魚[18]、鱈魚[19]和大馬哈魚[20]的新鮮度均具有較好的預(yù)測能力。而利用近紅外光譜技術(shù)分析檢測鮰魚新鮮度的研究尚未見報道。試驗擬以鮰魚為研究對象，采用高效液相色譜法(HPLC)分析凍融循環(huán)貯藏條件下ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的變化及其對新鮮度K值的影響，并利用偏最小二乘法建立新鮮度K值的近紅外定量預(yù)測模型，以期為水產(chǎn)品在運輸、貯藏和銷售過程中保持較佳新鮮度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

斑點叉尾鮰：魚體規(guī)格為(2.00±0.30) kg，共24條(依次編號為A～X)，帶水運輸至實驗室進(jìn)行后續(xù)處理，市售；

氫氧化鈉、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、高氯酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、腺苷酸(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黃嘌呤核苷(HxR)、次黃嘌呤(Hx)：色譜級，美國Sigma-Aldrich公司；

聚乙烯袋：上海廣佳信息技術(shù)有限公司；

旋渦混合器：WH966型，上?？等A生化儀器制造有限公司；

pH計：FE20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：GL-25Ms型，上海盧湘儀實驗室儀器有限公司；

超純水機(jī)：YLY-100BU型，深圳市億利源水處理設(shè)備有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

傅里葉變換近紅外光譜儀：AntarisⅡ型，美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理 鮰魚覆冰致暈后宰殺，去頭去尾后對半剖切，去除魚皮及紅肉，按圖1所示取背部肌肉約30 g，并切割為5份，每塊魚肉分別編號為1A、1B、…、5X，共計120份魚肉。用純水洗凈魚肉表面血跡，瀝干后放入聚乙烯袋中，-18 ℃下冷凍48 h，然后轉(zhuǎn)入4 ℃下解凍24 h，視為一次凍融循環(huán)處理，分別凍融循環(huán)處理1～5次。凍融循環(huán)處理后的120份鮰魚片樣品根據(jù)隨機(jī)抽取的原則，將其中100份作為校正集，其余20份作為驗證集。每份鮰魚片樣品先進(jìn)行近紅外光譜采集，隨后迅速剁碎制備新鮮度樣品。

1.2.2 近紅外光譜采集 將凍融循環(huán)處理后的120份鮰魚片放入樣品盒內(nèi)，用傅里葉變換近紅外光譜儀進(jìn)行光譜測定，每個樣品測量3次取平均值。

1.2.3 新鮮度測定

(1) 樣品處理：將采集完光譜學(xué)數(shù)據(jù)的鮰魚片在預(yù)冷過的砧板上剁碎混勻。準(zhǔn)確稱取2.000 g魚肉樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL預(yù)冷過的10%高氯酸溶液旋渦振蕩1 min，低溫離心10 min(4 ℃，8 000 r/min)后保留上清液。沉淀物加入10 mL預(yù)冷過的5%高氯酸溶液旋渦振蕩1 min，低溫離心10 min(4 ℃，8 000 r/min)保留上清液，重復(fù)上述操作1次，合并上清液。用1 mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至6.0～6.4，再用預(yù)冷過的超純水定容至50 mL。定容后的樣液用0.22 μm水相微孔濾膜過濾，濾液移入1.5 mL樣品瓶中，保存于-18 ℃待測。

圖1 鮰魚片取樣示意圖Figure 1 Catfish sampling

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：準(zhǔn)確稱取ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx等標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配制成濃度為1.00 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，其中Hx標(biāo)準(zhǔn)儲備液的濃度為0.50 mg/mL。用流動相配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使ATP、ADP、AMP、IMP、HxR的濃度梯度為0.2，0.5，1.0，5.0，15.0，40.0，100.0 μg/mL，Hx的濃度梯度為0.10，0.25，0.50，2.50，7.50，20.00，50.00 μg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其曲線方程見表1。

表1 ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Thestanard curves of ATP-related compound composition

(3) 色譜條件：色譜柱為月旭Ultimate AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相為0.02 mol/L KH2PO4溶液和0.02 mol/L K2HPO4溶液等體積混合后用85%磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20 μL。

(4) ATP關(guān)聯(lián)化合物含量計算：繪制ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照Yokoyama等[21]的方法，按式(1)計算ATP關(guān)聯(lián)化合物含量。

(1)

式中：

X——樣品中ATP關(guān)聯(lián)化合物含量，μmol/g；

C——標(biāo)準(zhǔn)工作液中ATP關(guān)聯(lián)化合物質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品提取液定容后體積，mL；

m——稱取樣品質(zhì)量，g；

M——6種ATP關(guān)聯(lián)化合物的分子質(zhì)量。

(5) K值計算：參照SC/T 3048—2014，按式(2)計算K值[22]。

(2)

式中：

K——新鮮度K值，%；

nATP——三磷酸腺苷的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；

nADP——二磷酸腺苷的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；

nAMP——腺苷酸的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；

nIMP——肌苷酸的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；

nHxR——次黃嘌呤核苷的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g；

nHx——次黃嘌呤的質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g。

一般認(rèn)為K值在20%以下為優(yōu)良鮮度指標(biāo)，20%～50%為中等鮮度指標(biāo)，超過60%為不可接受[23]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為P<0.05。參照管驍?shù)萚24]的方法，采用Unscrambler 9.7軟件對120份鮰魚片近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并采用偏最小二乘法(PLS)建立模型，通過校正決定系數(shù)(R2)、校正均方根誤差(RMSEC)、交叉驗證決定系數(shù)(R2)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)對模型預(yù)測能力進(jìn)行評價，優(yōu)化預(yù)測模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍融循環(huán)過程中ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的變化

由圖2(a)可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，ATP含量先顯著下降(P<0.05)后穩(wěn)定維持在較低濃度，這是由于ATP酶活隨貯藏時間的延長而迅速降低，與吳依蒙等[25]的結(jié)果一致。凍融循環(huán)5次后，ATP含量由初始的2.15 μmol/g降至0.02 μmol/g。在ATP酶的作用下，ATP迅速分解為ADP和AMP。前2次凍融循環(huán)過程中，魚肉內(nèi)ATP酶活性較高，ATP含量顯著下降。Watabe等[26]研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下魚肉肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Sarcoplasmicreticulum)吸收鈣離子的能力下降，肌原纖維中鈣離子濃度增加，從而激活Mg2+-ATP酶使ATP降解。

由圖2(b)可知，IMP含量隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加先升高后降低。第1次凍融循環(huán)，IMP含量由初始的4.07 μmol/g 顯著上升(P<0.05)至5.98 μmol/g；第2～5次凍融循環(huán)，IMP含量顯著降低(P<0.05)，由4.51 μmol/g 降至0.04 μmol/g。IMP是由AMP在其脫氨酶的作用下分解產(chǎn)生，隨后被核苷酸酶降解。凍融循環(huán)初期，ATP、ADP、AMP各自對應(yīng)的降解酶活性非常高，各種前體物質(zhì)被迅速降解為IMP，造成IMP含量的迅速升高。第2次凍融循環(huán)，IMP含量依然維持在一個較高的水平，處于蓄積狀態(tài)，與楊文鴿等[27]的結(jié)果一致；第3～5次凍融循環(huán)，IMP含量顯著降低。Songsaeng等[28]研究發(fā)現(xiàn)，貯藏中嗜冷菌的生長繁殖會造成IMP含量降低，如革蘭氏陽性菌(Gram-positivebacteria)和芽孢桿菌(Spore-formingbacteria)。5次凍融循環(huán)貯藏，鮰魚在4 ℃ 下共貯藏5 d，IMP含量僅為最高值的0.67%，降解速率遠(yuǎn)大于冰藏、冷藏和微凍條件。如大黃魚冰藏5 d后的IMP含量約為最高值的60%[27]；中華絨螯蟹冷藏5 d 后的IMP含量約為最高值的50%[29]；鰱魚微凍貯藏5 d后的IMP含量約為最高值的70%[9]。

小寫字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)圖2 凍融循環(huán)過程中鮰魚肉片ATP關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的變化Figure 2 Changes of ATP-related compound composition in catfish fillets during the freeze-thaw cycles

由圖2(c)可知，Hx含量隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而顯著升高(P<0.05)，第5次凍融循環(huán)時，Hx含量由初始的0.08 μmol/g上升至19.65 μmol/g。Hx是由HxR在核糖水解酶的作用下脫去核糖生成，是導(dǎo)致魚肉產(chǎn)生苦澀味的主要物質(zhì)[30]。根據(jù)魚肉中HxR與Hx含量變化的不同，可分為3種類型：HxR含量隨時間顯著增加為HxR型，如鰹魚(Katsuwonuspelamis)[26]；Hx含量顯著增加為Hx型，如棕點石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus)[31]；HxR、Hx含量均增加為中間型，如日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)[8]。故試驗鮰魚片中Hx含量屬于Hx型。

2.2 凍融循環(huán)過程中K值的變化

由圖3可知，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，K值呈顯著上升趨勢(P<0.05)。宰殺時，鮰魚片K值為5.33%；第1次凍融循環(huán)，K值為15.33%，鮰魚片處于優(yōu)良鮮度范圍內(nèi)；第2次凍融循環(huán)，K值達(dá)到28.94%，鮰魚片處于中等鮮度范圍內(nèi)；第3次凍融循環(huán)，K值變化極顯著(P<0.01)，達(dá)到67.95%，鮰魚片已進(jìn)入腐敗階段；第5次凍融循環(huán)，K值為93.96%，鮰魚片已完全腐敗。

小寫字母不同表示存在顯著性差異(P<0.05)圖3 凍融循環(huán)過程中鮰魚片K值的變化Figure 3 Change of K value in catfish fillets during the freeze-thaw cycle

凍融循環(huán)過程中，各種內(nèi)源性酶的作用及嗜冷微生物的生長繁殖造成ATP關(guān)聯(lián)化合物含量的變化，進(jìn)而造成K值的變化。其中，IMP含量的下降和Hx含量的上升是K值變化的主要因素。第3次凍融循環(huán)，由于IMP顯著下降，Hx顯著上升，最終造成K值極顯著升高(P<0.01)。姜楊等[1]研究表明，草魚冷藏15 d，新鮮度K值達(dá)80%，與鮰魚凍融循環(huán)4次的相當(dāng)；蔣晨毓等[31]研究表明，鳙魚冷藏16 d，新鮮度K值達(dá)90%，與鮰魚凍融循環(huán)5次的相當(dāng)。

2.3 新鮮度近紅外模型的建立及驗證

2.3.1 新鮮度近紅外模型的建立 120份凍融循環(huán)鮰魚片樣品的新鮮度K值最小為4.88%，最大為95.10%，校正集和驗證集的K值數(shù)據(jù)范圍均符合建立近紅外定量建模的需求。

由圖4可知，不同樣本的譜圖形狀極其相似，1 000～2 500 nm內(nèi)均有明顯吸收峰，其中2 000～2 500 nm范圍內(nèi)較為分散，1 000～1 400 nm范圍內(nèi)較為接近。1 150～1 200，1 400～1 450，1 900～1 950 nm處吸收峰為O—H鍵的倍頻及合頻吸收，受樣品中水分的影響，因魚肉中水分含量遠(yuǎn)超蛋白質(zhì)及脂肪等，因此O—H鍵的吸收峰非常明顯；1 500～1 550 nm處為N—H鍵伸縮振動產(chǎn)生的合頻吸收，受樣品中蛋白質(zhì)或氨基酸相關(guān)組分的影響；1 170～1 250 nm處為C—H鍵的倍頻吸收，受樣品中脂肪的影響。魚肉新鮮度的變化往往伴隨著水分、蛋白質(zhì)和脂肪含量的變化，其光譜變化為這些官能團(tuán)吸收峰的綜合表現(xiàn)。

圖4 120份鮰魚片樣品近紅外光譜圖Figure 4 NIR spectra of 120 catfish samples

由表2可知，濾波擬合法(SG)聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)處理的模型的校正和預(yù)測決定系數(shù)最高，校正和預(yù)測均方根誤差最低，模型預(yù)測效果最佳。

由圖5可知，模型預(yù)測決定系數(shù)R2為0.938 1，預(yù)測均方根誤差RMSEP為1.49，說明預(yù)測值和實測值差距較小，模型效果較好。

表2 建模條件優(yōu)化Table 2 Optimization of conditions for establishing calibration model

圖5 鮰魚片新鮮度校正模型和交叉驗證模型的實測值和預(yù)測值相關(guān)圖Figure 5 Correlation graph of measured and predicted values of the corrected model and cross-validation model for catfish fillets freshness

利用近紅外定量模型對樣品集的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測，計算該樣品的新鮮度K值，并與該樣品的實測值進(jìn)行比較，驗證該模型的準(zhǔn)確性。20份驗證集樣品的t=0.964 272

2.3.2 新鮮度近紅外模型的驗證 為驗證PLS模型的預(yù)測精確度，將未參與建模的20份驗證樣品組成的驗證集代入模型進(jìn)行驗證，并將模型預(yù)測值與實測值進(jìn)行比較分析，其結(jié)果見表3，樣本方差分析見表4。

由表4可知，F(xiàn)

表3 鮰魚片新鮮度模型預(yù)測值與實測值比較Table 3 Comparison of predicted value and measured value of freshness of catfish fillets %

表4 雙樣本方差分析Table 4 Two-sample analysis of variance

3 結(jié)論

測定了凍融循環(huán)過程中鮰魚片的新鮮度并建立了近紅外預(yù)測模型。結(jié)果表明，隨著凍融循環(huán)次數(shù)的增加，鮰魚片樣本的三磷酸腺苷含量先急劇下降后維持在較低水平；肌苷酸含量先上升后下降，有一個蓄積過程；次黃嘌呤含量顯著上升；K值顯著上升(P<0.05)，凍融循環(huán)3次后，K值>60%，鮰魚片開始腐敗。近紅外光譜數(shù)據(jù)經(jīng)濾波擬合法及標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換預(yù)處理后，采用偏最小二乘法建立的預(yù)測模型的預(yù)測值決定系數(shù)最高(R2=0.938 1)，預(yù)測均方根誤差最低(RMSEP=1.49)，效果最佳。驗證集樣品的t

研究尚未探討凍融循環(huán)處理鮰魚片新鮮度變化的原因，后續(xù)可圍繞凍融循環(huán)處理對魚肉組織中三磷酸腺苷降解關(guān)鍵酶的釋放及活性變化等方面進(jìn)行研究，闡明鮰魚片在凍融循環(huán)處理過程中的新鮮度變化機(jī)理。此外，研究所建立的模型只能根據(jù)測定的近紅外光譜數(shù)據(jù)快速預(yù)測鮰魚片當(dāng)前新鮮度(K值)，后續(xù)可結(jié)合貯運過程中溫度數(shù)據(jù)預(yù)測鮰魚片新鮮度變化趨勢，實現(xiàn)對低溫貯運條件的優(yōu)化與控制。