李坤陽(yáng)陳 棟左春然劉愛(ài)群朱蘭省牛 兵

(1.河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院)口腔科,鄭州 450001; 2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院·河南省口腔醫(yī)院口腔科,鄭州 450052)

人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)是從牙齒上分離出的成體間充質(zhì)干細(xì)胞,具有高度增殖能力,且具有多向分化潛能,是牙齒再生的重要細(xì)胞[1]。 因此hDPSCs 的定向分化對(duì)于牙齒再生至關(guān)重要。 細(xì)胞液泡分選蛋白 4B(vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)在 hDPSCs 中高表達(dá),可促進(jìn)向成牙本質(zhì)分化,但機(jī)制尚不明確[2]。Notch 通路與細(xì)胞增殖、分化等關(guān)系密切,并且?guī)缀跎婕皺C(jī)體所有器官、組織和細(xì)胞,在牙齒發(fā)育和再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-4]。 Notch 受體釋放其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellular domain,NICD)作為Notch 通路激活金標(biāo)準(zhǔn),過(guò)表達(dá) NICD 可以抑制hDPSCs 分化[5]。 推測(cè) VPS4B 可能調(diào)控 Notch 通路影響hDPSCs 成牙本質(zhì)分化。 因此,本研究采用礦化液和干擾VPS4B 同時(shí)處理hDPSCs,探討其對(duì)成牙本質(zhì)分化的影響,并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

收集本院18 ～30 歲因正畸或阻生齒拔除的健康完整恒牙,無(wú)菌工作臺(tái)上取出牙髓,分離純化和鑒定得hDPSCs[6]。 經(jīng)核實(shí),所有操作經(jīng)患者知情同意并簽訂知情同意書(shū),本研究經(jīng)本院倫理協(xié)會(huì)審核并通過(guò)(20190014)。

1.2 主要試劑與儀器

地塞米松、維生素、β-甘油磷酸鈉、茜素紅(德國(guó) Sigma 公 司, 批 號(hào) 分 別 為: 170412、 181113、171207、180415);脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(賽默飛世爾公司,批號(hào):20170418);一抗VPS4B、NICD、hairy 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 1(hairy and enhancer of split-related with YRPW motif1,Hey1)、GAPDH、鈣濃度檢測(cè)試劑盒(美國(guó)abcam 公司,批號(hào)分 別 為: ab224736、 ab83232、 ab22614、 ab181602、ab102505);VPS4B-siRNA、陰性對(duì)照 siRNA、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (runt-related transcription factor2,Runx2)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoproprotein,DSPP)引物序列均由生工生物工程股份有限公司合成。 CO2培養(yǎng)箱(深圳瑞沃德公司,型號(hào):D180-P);酶標(biāo)儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)儀(賽默飛世爾公司,型號(hào)分別為:Multiskan Sky、7500);凝膠成像系統(tǒng)(上海天能公司,型號(hào):4800)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及處理

參考文獻(xiàn)[7]設(shè)計(jì)VPS4B-siRNA,VPS4B-siRNA-1 ∶5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’、VPS4B-siRNA-2 ∶ 5 ’-AACATTTGAGAAACGAATT-3 ’、VPS4B-siRNA-3 ∶5’-TGATCCTAACCATCTTGTA-3’,最終三者 1 ∶1 ∶1混合為 VPS4B-siRNA。 陰性對(duì)照siRNA: 5 ’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ’。VPS4B-siRNA 及陰性對(duì)照 siRNA 均用 50 μL 無(wú)血清 MEM 稀 釋 成 20 μmol/L; 2 μL 脂 質(zhì) 體Lipofectamine 2000 用 50 μL DMEM 培養(yǎng)液稀釋,輕輕混勻后室溫孵育5 min,上述稀釋的siRNA 與稀釋的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 輕輕混合后室溫孵育20 min,現(xiàn)配現(xiàn)用。

10% FBS+90% DMEM 培養(yǎng)液制成完全培養(yǎng)液培養(yǎng)hDPSCs,采用生長(zhǎng)良好的第3 代hDPSCs 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)分為正常組、礦化組、陰性對(duì)照組、VPS4B-siRNA 組。 正常組正常培養(yǎng)相同時(shí)間,其余組添加礦化液(0.785 g/L 地塞米松、0.05 g/L 維生素、2.16 g/L β-甘油磷酸鈉),在添加礦化液基礎(chǔ)上陰性對(duì)照組(添加脂質(zhì)體Lipofectamine 2000+陰性對(duì) 照 siRNA)、 VPS4B-siRNA 組 (添 加 脂 質(zhì) 體Lipofectamine 2000+VPS4B-siRNA),6 h 后棄去培養(yǎng)液再添加含礦化液完全培養(yǎng)液培養(yǎng),其余2 d 換一次液,置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d。

1.3.2 蛋白免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞中VPS4B、NICD、Hey1 蛋白水平

按1.3.1 對(duì)細(xì)胞處理后,蛋白裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min,4℃ 12000 r/min 離心20 min,上清為總蛋白,凝膠電泳分離蛋白,PVDF 轉(zhuǎn)膜,分別加入一抗 VPS4B、NICD、Hey1、GAPDH 置于 4℃孵育過(guò)夜,添加對(duì)應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。 凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度。 目的蛋白相對(duì)表達(dá)=目的蛋白條帶灰度/GAPDH 條帶灰度。

1.3.3 CCK8 檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板中,添加200 μL 培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁后添加CCK8 試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞光密度OD450(optic density,OD)。

1.3.4 茜素紅染色觀察細(xì)胞分化情況

按1.3.1 處理各組細(xì)胞,棄去培養(yǎng)液,40 g/L 多聚甲醛固定,茜素紅染液染色,肉眼及倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)情況。 Image-J 軟件定量分析,每個(gè)樣品顯微鏡視野下計(jì)數(shù)5 個(gè)孔,求平均值,每個(gè)視野下礦化結(jié)節(jié)數(shù)量為礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量。

1.3.5 鈣濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞鈣水平

按1.3.1 處理細(xì)胞后按照鈣濃度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配置 MTB 試劑和堿性溶液,鈣標(biāo)準(zhǔn)液 2.5 mmol/L,4℃避光保存。 100 μL MTB+200 μL 堿性溶液+各10 μL(待測(cè)樣品、鈣標(biāo)準(zhǔn)液、ddH2O),混勻后置于1 cm 比色皿,ddH2O 用于調(diào)零,測(cè)定OD610。待測(cè)樣品鈣濃度=OD測(cè)定管/OD標(biāo)準(zhǔn)管×2.5。

1.3.6 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中 Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平

按1.3.1 方法處理細(xì)胞后,RNA 提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 試劑盒合成 cDNA,qRTPCR 儀檢測(cè)細(xì)胞中 Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平。引 物 序 列 Runx2-F: 5 ’-CCATAACCGTCTTCAC AAATCC-3’、R:5’-GCGGGACACCTACTCTCATACT-3’,OPN-F:5’-ACACATATGATGGCCGAGGTG-3’、R:5’-GTGTGAGGTGATGTCCTCGTCTGTA-3,DSPPF: 5 ’-CCATTCCCACGGACTCCCA-3 ’、 R: 5 ’-TGGCGATGCAGGTCACAAT-3’,20 μL 反應(yīng)體系:2×mix 10 μL,ddH2O 7.8 μL,50 ng/μL cDNA 1 μL,(F/R)(0.6/0.6)μL。 反應(yīng)條件:94℃、90 s;94℃、60 s,61℃、60 s,40 個(gè)循環(huán)。 2-ΔΔCt法計(jì)算 Runx2、OPN、DSPP mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。 8 個(gè)平行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾VPS4B 對(duì)hDPSCs VPS4B 蛋白的影響

與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組VPS4B 蛋白水平升高(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組VPS4B 蛋白水平降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖1、表1。

2.2 干擾VPS4B 對(duì)hDPSCs 增殖的影響

與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組、VPS4B-siRNA 組OD450水平降低(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組OD450水平降低(P<0.05)。 見(jiàn)表2。

圖1 4 組細(xì)胞中VPS4B 蛋白表達(dá)情況Figure 1 Expression of VPS4B protein in 4 groups of cells

2.3 干擾VPS4B 對(duì)hDPSCs 成牙本質(zhì)分化的影響

正常組茜素紅染色較淺,面積較小。 與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組、VPS4B-siRNA 組染色較深,且面積較大,礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量升高(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組染色顏色有所減輕,面積減少,礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖2、表3。

2.4 干擾VPS4B 對(duì)hDPSCs 鈣化的影響

與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組鈣濃度升高(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組鈣濃度降低(P<0.05)。 見(jiàn)表4。

表1 4 組細(xì)胞VPS4B 蛋白水平比較( ±s,n=8)Table 1 Comparison of VPS4B protein levels in 4 groups of cells

表1 4 組細(xì)胞VPS4B 蛋白水平比較( ±s,n=8)Table 1 Comparison of VPS4B protein levels in 4 groups of cells

注:與正常組相比,#P<0.05;與礦化組相比,?P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,&P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the mineralized group, ?P<0.05.Compared with the negative control group,&P<0.05.

組別Groups VPS4B正常組Normal group 0.11±0.02礦化組Mineralized group 0.47±0.05#陰性對(duì)照組Negative control group 0.49±0.04#VPS4B-siRNA 組VPS4B-siRNA group 0.16±0.03?&F 237.975 P 0.000

表2 4 組細(xì)胞OD450比較( ±s,n=8)Table 2 Comparison of OD450 in 4 groups of cells

表2 4 組細(xì)胞OD450比較( ±s,n=8)Table 2 Comparison of OD450 in 4 groups of cells

注:與正常組相比,#P<0.05;與礦化組相比,?P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,&P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P < 0.05.Compared with the mineralized group, ?P<0.05.Compared with the negative control group,&P<0.05.

組別Groups OD450正常組Normal group 2.14±0.05礦化組Mineralized group 1.24±0.15#陰性對(duì)照組Negative control group 1.28±0.12#VPS4B-siRNA 組VPS4B-siRNA group 0.87±0.05#?&F 220.786 P 0.000

圖2 4 組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果Figure 2 Results of alizarin red staining in 4 groups of cells

表3 4 組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量比較( ±s,n=8)Table 3 Comparison of relative number of mineralized nodules in 4 groups of cells

表3 4 組細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量比較( ±s,n=8)Table 3 Comparison of relative number of mineralized nodules in 4 groups of cells

注:與正常組相比,#P<0.05;與礦化組相比,?P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,&P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the mineralized group, ?P<0.05.Compared with the negative control group,&P<0.05.

組別Groups礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量(n)Relative number of mineralized nodules正常組Normal group 13.45±3.56礦化組Mineralized group 73.58±6.89#陰性對(duì)照組Negative control group 71.74±5.47#VPS4B-siRNA 組VPS4B-siRNA group 48.98±5.18#?&F 214.482 P 0.000

表4 4 組細(xì)胞鈣濃度比較( ±s,n=8)Table 4 Comparison of calcium concentration in 4 groups of cells

表4 4 組細(xì)胞鈣濃度比較( ±s,n=8)Table 4 Comparison of calcium concentration in 4 groups of cells

注:與正常組相比,#P<0.05;與礦化組相比,?P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,&P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the mineralized group, ?P<0.05.Compared with the negative control group,&P<0.05.

組別Groups鈣濃度(mmol/L)Calcium concentration正常組Normal group 1.53±0.18礦化組Mineralized group 2.48±0.45#陰性對(duì)照組Negative control group 2.50±0.43#VPS4B-siRNA 組VPS4B-siRNA group 1.95±0.25?&F 14.395 P 0.000

2.5 干擾 VPS4B 對(duì) hDPSCs 中 Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平的影響

與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組 Runx2、OPN、DSPP mRNA 水 平 升 高, VPS4B-siRNA 組OPN、DSPP mRNA 水平升高(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平降低(P<0.05)。 見(jiàn)圖3。

2.6 干擾VPS4B 對(duì)hDPSCs 中Notch 通路蛋白的影響

與正常組相比,礦化組、陰性對(duì)照組、VPS4B-siRNA 組細(xì)胞中 NICD、Hey1 蛋白水平降低(P<0.05);分別與礦化組、陰性對(duì)照組相比,VPS4B-siRNA 組 NICD、Hey1 蛋白水平升高(P<0.05)。 見(jiàn)圖4、表5。

3 討論

hDPSCs 具有多向分化和自我更新能力,牙髓損傷可促使hDPSCs 遷移至受損部位定向分化,從而修復(fù)損傷,檢測(cè)未分化和分化后基因表達(dá)差異對(duì)于維持hDPSCs 定向分化具有重要意義[8]。 VPS4B 作為AAA-ATPase 家族成員,VPS4B 的破壞可能導(dǎo)致某些功能改變,主要表現(xiàn)為改變VPS4B 二級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其功能降低或喪失;VPS4B 基因突變已成為牙本質(zhì)異常的致病基因[9-10]。 但具體機(jī)制尚不清楚,因此研究VPS4B 在hDPSCs 成牙本質(zhì)分化的機(jī)制對(duì)于治療疾病意義重大。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,礦化組VPS4B 蛋白水平升高;提示礦化hDPSCs可促進(jìn) VPS4B 蛋白的表達(dá)。 與礦化組相比,VPS4B-siRNA 組 VPS4B 蛋白水平降低;說(shuō)明干擾VPS4B 后礦化hDPSCs 細(xì)胞中蛋白水平下降,干擾成功。 與正常組相比,礦化組OD450下降,礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量、鈣濃度升高,提示礦化 hDPSCs 促進(jìn)VPS4B 表達(dá),可抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)成牙本質(zhì)分化。與礦化組相比,VPS4B-siRNA 組茜素紅染色顏色有所減輕,面積減少,OD450、礦化結(jié)節(jié)相對(duì)數(shù)量、鈣濃度降低;提示干擾VPS4B 后進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖、hDPSCs 成牙本質(zhì)分化。

Runx2 具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),可以結(jié)合在靶基因的啟動(dòng)子上從而調(diào)控眾多成骨相關(guān)的靶基因,如骨鈣素、OPN 等,影響細(xì)胞分化;增強(qiáng)Runx2 表達(dá)可促進(jìn)hDPSCs 分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞[11-12]。 OPN 可結(jié)合羥基磷灰石晶體從而參與鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,在初期礦化中起重要作用;DSPP 作為牙本質(zhì)特異性蛋白,其水平反映 hDPSCs 成牙本質(zhì)分化水平[13-14]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,礦化組Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平升高,提示 Runx2 促進(jìn)參與礦化過(guò)程中的OPN 和形成牙本質(zhì)的相關(guān)基因水平升高,促進(jìn)hDPSCs 牙本質(zhì)分化。 與礦化組相比,VPS4B-siRNA 組 Runx2、OPN、DSPP mRNA 水平降低,提示干擾 VPS4B 后 Runx2 水平降低,對(duì)OPN 的促進(jìn)作用減弱,導(dǎo)致牙本質(zhì)分化相關(guān)基因如DSPP 等水平降低,hDPSCs 牙本質(zhì)分化能力減弱。

圖4 4 組細(xì)胞中NICD、Hey1 蛋白表達(dá)情況Figure 4 Expression of NICD and Hey1 protein in 4 groups of cells

表5 4 組細(xì)胞NICD、Hey1 蛋白水平比較( ±s,n=8)Table 5 Comparison of NICD and Hey1 protein levels in 4 groups of cells

表5 4 組細(xì)胞NICD、Hey1 蛋白水平比較( ±s,n=8)Table 5 Comparison of NICD and Hey1 protein levels in 4 groups of cells

注:與正常組相比,#P<0.05;與礦化組相比,?P<0.05;與陰性對(duì)照組相比,&P<0.05。Note.Compared with the normal group, #P<0.05.Compared with the mineralized group, ?P<0.05.Compared with the negative control group,&P<0.05.

組別Groups Notch 受體釋放其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域NICD Hairy 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1 Hey1正常組Normal group 0.57±0.06 0.72±0.05礦化組Mineralized group 0.13±0.04# 0.11±0.01#陰性對(duì)照組Negative control group 0.14±0.05# 0.13±0.04#VPS4B-siRNA 組VPS4B-siRNA group 0.46±0.05#?& 0.43±0.05#?&F 157.386 396.856 P 0.000 0.000

活化Notch 信號(hào)通路可暴露出NICD,活化的NICD 可與DNA 結(jié)合蛋白結(jié)合,從而活化 Notch 靶基因, Hey1 作為 Notch 靶基因可受 NICD 調(diào)控[15-17]。 Hey1 可與DNA 蛋白結(jié)合從而發(fā)揮作用,被認(rèn)為轉(zhuǎn)錄抑制物,可與Runt 結(jié)構(gòu)家族羧基端結(jié)合從而發(fā)揮作用[18-19]。 同時(shí)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)NICD 可直接抑制Runx2 的表達(dá)從而抑制成骨分化[20]。 本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,礦化組細(xì)胞中NICD、Hey1 蛋白水平降低,提示 hDPSCs 成牙本質(zhì)分化過(guò)程中NICD 受到抑制,調(diào)控Hey1 的作用減弱,從而導(dǎo)致Hey1 對(duì)Runx2 的轉(zhuǎn)錄抑制作用減弱,促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)分化。 與礦化組相比,VPS4B-siRNA 組NICD、Hey1 蛋白水平升高,提示干擾 VPS4B 后VPS4B 二級(jí)結(jié)構(gòu)改變,而改變ATP 的結(jié)合結(jié)構(gòu),導(dǎo)致ATP 功能改變,經(jīng)過(guò)一系列影響,激活 NICD,NICD 調(diào)控 Hey1 水平升高,Hey1 對(duì) Runx2 的抑制作用加強(qiáng),Runx2 水平降低調(diào)控 OPN、DSPP 能力降低,hDPSCs 分化能力降低,導(dǎo)致疾病發(fā)生。

綜上所述,干擾VPS4B 后可抑制hDPSCs 牙本質(zhì)分化,可能是通過(guò)激活 Notch 通路實(shí)現(xiàn)的。 但VPS4B 與Notch 之間的作用結(jié)合部位尚未發(fā)現(xiàn),仍需深入探究分析。