張靜怡鄧永寧張 萌屈秋民?

(1.河南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學科,鄭州大學人民醫(yī)院,鄭州 450003;2.西安交通大學第一醫(yī)院神經(jīng)內科,西安 710061)

隨著全球人口老齡化,衰老問題日益突出,尋找衰老相關疾病的治療靶點成為研究的熱點。Sirtuin 家族是一種線粒體NAD 依賴的去乙?；?越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Sirtuin 家族七個成員(Sirt1-Sirt7)與衰老相關疾病密切相關[1-2]。Sirt3 主要位于線粒體內,研究發(fā)現(xiàn)它通過改善線粒體功能、減輕氧化應激、增加三磷酸腺苷(ATP)生成、抑制凋亡等機制,在衰老相關的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護作用[3-5]。 帕金森病作為第二大神經(jīng)退行性疾病,嚴重影響了患者的生活質量并且威脅著患者的生命,給社會增加了沉重的經(jīng)濟負擔。 帕金森病的發(fā)病機制包括線粒體功能障礙、氧化應激等[6],所以Sirt3 在其中的作用研究受到關注。 本實驗利用基因干擾RNAi(RNA interference)技術,擬構建含有RNAi 片段的慢病毒載體,抑制人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 細胞中Sirt3 基因的表達。 人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 細胞具有多巴胺能神經(jīng)元的特性,是帕金森病體外細胞模型中常用的細胞。 實驗擬構建穩(wěn)定沉默Sirt3 基因表達的細胞株,為后續(xù)研究Sirt3 在帕金森病細胞模型中的作用提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞

人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)購買于美國ATCC;293T 細胞購自中科院上海細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑與儀器

GV248 載體、pHelper 1.0 載體,pHelper 2.0 載體購自上海吉凱基因技術有限公司;PCR 用試劑primer(R&F)、dsDNA oligo 均購自上海吉凱基因技術有限公司;質粒提取試劑盒購自QIAGEN 公司;Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen;SYBR Real-time PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;RNA 提取試劑盒購自飛捷生物公司;胎牛血清、胰蛋白酶、細胞培養(yǎng)基均購自Hyclone, USA;Western blot 制膠試劑盒購自西安先鋒生物科技有限公司;β-actin 鼠抗單克隆抗體及 HRP 標記山羊抗兔 IgG(sc-2005)購買于Santa Cruz, USA;Sirt3 兔抗多克隆抗體購買于Abcams,UK;二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Election,USA);高速臺式離心機(上海市安亭科學儀器廠);PCR 儀(Applied Biosystems);生物安全柜(上海力申科學儀器有限公司);熒光顯微鏡(Nikon, Tokyo,Japan)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNAi 慢病毒載體的制備

(1)siRNA 的設計合成

利用RNAi 設計軟件按照RNA 干擾序列設計原則,設計合成4 條針對人Sirt3 基因(GenBank:NM_004612)的siRNA 干擾序列和1 條陰性對照序列,4 條 siRNA 序 列 分 別 為: SIRT3-RNAi-1 ∶5’-ACCTGCACAGTCTGCCAAA-3’;SIRT3-RNAi-2 ∶5’-GGCTCTACACGCAGAACAT-3’;SIRT3-RNAi-3 ∶5’-CAACGTCACTCACTACTTT-3’;SIRT3-RNAi-4 ∶5’-GGGTGCTTCAAGTGTTGTT-3’。 陰性對照序列:5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。 序列由吉凱基因技術有限公司合成。 同時,用BLAST 同源性分析確認4 對干擾片段的特異性。

(2)RNAi 慢病毒載體的構建

根據(jù)以上設計的靶序列,首先合成含各干擾序列及陰性對照的單鏈DNA oligo(見表1),然后退火配對產生雙鏈DNA,再通過T4 連接酶將DNA 片段與經(jīng)過AgeI 和EcoRI 雙酶切后的GV248 線性化載體(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)在適當?shù)木彌_液中進行連接;將連接產物轉入制備好的細菌感受態(tài)細胞,PCR 鑒定陽性重組子,利用質粒試劑盒提取質粒,然后送DNA 測序分析進行驗證。

表1 Oligo 序列Table 1 Oligo sequence

1.3.2 慢病毒載體的包裝與滴度測定

(1)慢病毒載體的包裝

將重組慢病毒質粒、pHelper 1.0 載體、pHelper 2.0 載體與Opti-MEM 混合均勻進行稀釋,同時也將Lipofectamine 2000 試劑稀釋,然后將二者進行混合,轉移至293T 細胞的培養(yǎng)液中;轉染8 h 后棄掉含有轉染液的培養(yǎng)基,PBS 液洗后加入10%血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 收集轉染后48 h 的 293T 細胞上清液,于4℃,4000 r/min 離心10 min,除去細胞碎片,以0.45 μm 濾器過濾離心后收集病毒液。

(2)慢病毒載體的滴度測定

將293T 細胞鋪板;準備8 個無菌的Ep 管,在每個管中加入90 μL 的無血清培養(yǎng)基。 然后取待測定的病毒原液10 μL 加入到第一個管中混勻,再從中取10 μL 加到第二個管中,繼續(xù)相同的操作直到最后一管進行稀釋。 將細胞孔中的培養(yǎng)基吸去90 μL丟棄,然后加入等量稀釋好的病毒溶液放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 24 h 后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 4 d 后觀察熒光表達情況,病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數(shù)除以病毒原液量。

1.3.3 慢病毒感染SH-SY5Y 細胞

復蘇SH-SY5Y 細胞,將細胞分為六組:空白對照組(CON)為不加入病毒液而僅僅加入普通培養(yǎng)基的細胞,陰性對照組(NC)是感染陰性對照病毒的細胞、LV-Sirt3-RNAi-1 組、LV-Sirt3-RNAi-2 組、LVSirt3-RNAi-3 組、LV-Sirt3-RNAi-4 組是分別感染了LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒的細胞。 將細胞鋪于六孔板中進行培養(yǎng),提前進行慢病毒轉染的預實驗確定好MOI 值,從而據(jù)此計算加入病毒液的量。 感染3 d后在熒光顯微鏡下觀察細胞內熒光表達情況,若80%細胞均表達熒光則表明慢病毒感染成功。

1.3.4 Real-time PCR

收集以上6 組 SH-SY5Y 細胞,按照 RNA 提取試劑盒操作流程提取總RNA,并測定RNA 濃度。將提取的RNA 與試劑盒中的試劑配成反應液,按照37℃、15 min,85℃、5 s,4℃反應條件進行反轉錄反應,然后將反轉錄液按照操作流程進行Real-time PCR 反應。Sirt3 引物:上游引物:5’-TCCTCCTTCC TAGCATCACA-3’, 下 游 引 物 5’-ATCATAACACC GCACTCCA-3’,以 GAPDH 為內參,上游引物為:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游引物為:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’。 采用 2-ΔΔCt法計算Sirt3 RNA 表達水平。

1.3.5 Western blot

收集以上6 組細胞,配取裂解液裂解細胞提取蛋白,然后用BCA 法測定蛋白濃度;按照Western blot 說明書、根據(jù)目的蛋白分子量制膠,然后在膠中加入蛋白液上樣,進行SDS-PAGE 電泳,電泳結束后將蛋白轉移到PVDF 膜上。 將 PVDF 膜放在PBST緩沖液中漂洗后立即用5%脫脂牛奶的封閉2 h,然后用一抗(Sirt3、內參β-actin)、二抗進行孵育。 PBS液充分洗膜后發(fā)光成像。

1.3.6 確定嘌呤霉素篩選最佳濃度及獲得穩(wěn)定表達細胞株

將SH-SY5Y 細胞鋪板培養(yǎng)24 h,吸取各孔中的細胞培養(yǎng)基,依次加入嘌呤霉素濃度為 0、2、4、6、8、10 μg/μL 的新鮮無血清的培養(yǎng)基。 每天在鏡下觀察細胞生長狀況,3 ～5 d 后能夠使幾乎所有細胞死亡的最小嘌呤霉素濃度即為最佳濃度。 應用慢病毒感染后的SH-SY5Y 細胞中加入確定濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)可以得到穩(wěn)定表達細胞株。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件錄入和分析數(shù)據(jù)。 實驗均重復三次,得到的計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示,計量資料間進行比較采用方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 干擾 Sirt3 表達的 siRNA 成功插入慢病毒載體

對重組干擾慢病毒陽性克隆進行DNA 測序,結果顯示:插入的針對Sirt3 基因的siRNA 核苷酸序列正確,即構建的干擾Sirt3 基因表達的4 種siRNA 重組慢病毒干擾載體的DNA 序列與設計的序列完全相符,結果表明成功構建了4 個沉默Sirt3 基因的慢病毒載體。 (見圖1、2、3、4)

2.2 慢病毒載體成功轉染進293T 細胞

重組慢病毒質粒與2 種包裝質粒共轉染293T細胞,轉染后第2 天在倒置熒光顯微鏡下觀察,可以看到細胞內發(fā)出綠色熒光(見圖5),收集濃縮病毒液測定病毒滴度,根據(jù)熒光細胞數(shù)計算病毒的滴度為: LV-SIRT3-RNAi-1 8 × 108TU/mL、 LV-SIRT3-RNAi-2 3×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-3 8×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-4 8×108TU/mL。 這表明慢病毒載體成功轉染進293T 細胞,成功包裝的慢病毒載體可以用于后續(xù)的研究。

圖1 SIRT3-RNAi-1 慢病毒載體測序結果Figure 1 Sequencing result of SIRT3-RNAi-1 lentiviral vetor

圖2 SIRT3-RNAi-2 慢病毒載體測序結果Figure 2 Sequencing result of SIRT3-RNAi-2 lentiviral vetor

圖3 SIRT3-RNAi-3 慢病毒載體測序結果Figure 3 Sequencing result of SIRT3-RNAi-3 lentiviral vetor

圖4 SIRT3-RNAi-4 慢病毒載體測序結果Figure 4 Sequencing result of SIRT3-RNAi-4 lentiviral vetor

圖5 慢病毒載體共轉染293T 細胞24 hFigure 5 Lentiviral vectors were co-transfected into the 293T cells for 24 h

2.3 LV-Sirt3-RNAi-3 顯著抑制 Sirt3 mRNA 表達

慢病毒感染人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y 細胞,實驗分為六組。 Real-time PCR 方法檢測六組SH-SY5Y細胞中Sirt3 mRNA 表達量分別是:CON (1.0854±0.0944),NC(1.1706±0.0167),LV-Sirt3-RNAi-1 組(1.0875 ± 0.0156), LV-Sirt3-RNAi-2 組 (1.3492 ±0.0697),LV-Sirt3-RNAi-3 組(0.2630±0.0184),LVSirt3-RNAi-4 組(1.2490±0.0049)。 統(tǒng)計學分析顯示,LV-Sirt3-RNAi-3 組的 SH-SY5Y 細胞中Sirt3 mRNA表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 (見圖6)

2.4 LV-Sirt3-RNAi-3 顯著抑制Sirt3 蛋白表達

六組 SH-SY5Y 細胞中 Sirt3 蛋白表達量分別是:CON 組 (0.4038 ± 0.0355),NC 組 (0.4638 ±0.0411),LV-Sirt3-RNAi-1 組(0.4533±0.0750),LVSirt3-RNAi-2 組(0.5491±0.0683),LV-Sirt3-RNAi-3組(0.1633±0.0132),LV-Sirt3-RNAi-4 組(0.5167±0.0416)。 統(tǒng)計學分析結果提示LV-Sirt3-RNAi-3 組的SH-SY5Y 細胞中Sirt3 蛋白表達量顯著低于空白對照組和陰性對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。 (見圖7)

注:CON 組代表沒有感染病毒的SH-SY5Y 細胞內Sirt3 mRNA表達量,其余五組依次代表SH-SY5Y 細胞感染陰性對照病毒(NC)、 LV-Sirt3-RNAi-1、 LV-Sirt3-RNAi-2、 LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后細胞內 Sirt3 mRNA 的表達量。 與空白對照組(CON)相比,?P<0.001;與陰性對照組相比,#P<0.001。圖6 各組慢病毒感染SH-SY5Y 細胞后Sirt3 mRNA 的表達Note.CON group bar shows Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LVSirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group, ?P<0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 6 Sirt3 mRNA expression in different cells infected by corresponding lentivirus

2.5 LV-Sirt3-RNAi-3 轉染 SH-SY5Y 細胞穩(wěn)定表達綠色熒光

加入嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達株通過嘌呤霉素濃度確定實驗,2 μg/μL 含有嘌呤霉素培養(yǎng)基為最佳濃度。 在LV-Sirt3-RNAi-3 組細胞中加入嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達株。在熒光顯微鏡下觀察,通過可見光視野與熒光視野對比, 可見 90% 以上細胞均可見綠色熒光。(見圖8)

注:左圖為Western blot 代表圖,β-actin 為內參;右圖為Sirt3的相對表達量,CON 組代表沒有感染病毒的SH-SY5Y 細胞內Sirt3 蛋白表達量,其余五組依次代表SH-SY5Y 細胞感染陰性對照病毒(NC)、LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后細胞內 Sirt3 蛋白的表達量。 與空白對照組(CON)相比,?P<0.001;與陰性對照組相比,#P<0.001。圖7 各組慢病毒感染SH-SY5Y細胞后Sirt3 蛋白表達Note.Left graph shows Western blot images, β-actin was used as a loading control.Right bar graph shows relative expression of Sirt3.CON group bar shows Sirt3 protein expression in SHSY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 protein expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LV-Sirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group,?P < 0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 7 Sirt3 protein expression in different cells infected by corresponding lentivirus

3 討論

Sirt3 基因定位在11 號染色體(11p15.5)上,主要存在于腎、心臟、腦、棕色脂肪等代謝活躍的組織中[7]。 早期對Sirt3 基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn),Sirt3 基因外顯子3 上G447T 堿基顛換與老年男性長壽有著緊密聯(lián)系[8]。 也有研究發(fā)現(xiàn)通過節(jié)食(熱量限制) 延緩動物衰老進程的機制可能是激活了Sirt3[9]。 后來的大量針對Sirt3 的生物功能研究,證實了Sirt3 作為一種去乙?；?可以通過去乙?；L鏈乙酰脫氫酶( LCAD)、 AceCS2 ( acetyl-CoAsynthetase II)酶、異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)等調控細胞內的能量代謝平衡[10],Sirt3 還通過去乙?；疢nSOD、SOD2 等并增加其活性從而減少氧化應激損傷[11],此外Sirt3 可以減少活性氧介導的線粒體DNA 損傷[12]。 這些研究讓人們意識到Sirt3 在衰老、腫瘤等疾病中的潛在作用[13]。 近年來,Sirt3 在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病、肌萎縮側索硬化癥等疾病的研究中,均證實了Sirt3 的神經(jīng)保護作用[14-16]。 帕金森病是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,以中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死及殘存的神經(jīng)元內出現(xiàn)路易小體為主要病理特點[17]。 目前對帕金森病的發(fā)病機制研究認為,主要是線粒體功能障礙、氧化應激損傷增加、α-Synuclein 蛋白的異常沉積以及三者之間的相關影響[18-20]。 在MPTP 誘導的帕金森病小鼠模型中發(fā)現(xiàn),中腦組織Sirt3 的表達量減少,且Sirt3 的減少加劇了黑質紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退化[21]。 實驗研究表明,褪黑激素通過上調Sirt3 表達抵抗PD多巴胺能神經(jīng)元損傷,作用機制與其抑制小膠質細胞激活減輕氧化應激和炎癥損傷有關[22]。 柴胡皂甙d 對MPP+誘導的SH-SY5Y 細胞具有神經(jīng)保護作用,且機制可能為上調Sirt3 的表達水平[23]。 另有研究發(fā)現(xiàn)嘌呤生物堿Theacrine 通過激活線粒體Sirt3,抑制ROS 生成,最終抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[24]。 馬振凱等作者實驗中發(fā)現(xiàn),姜黃素可降低SH-SY5Y 細胞 ROS 水平,上調Sirt3 表達[25]。 以上結果提示,Sirt3 與PD 發(fā)生具有一定的關系,但關于Sirt3 在PD 發(fā)展中具體作用分子機制的研究,還不夠深入。

RNA 干擾(RNA interference,RNAi)技術,通過導入與靶基因mRNA 序列具有同源性的雙鏈RNA,誘導同源靶基因mRNA 的降解,從而沉默該基因表達[26]。 慢病毒來源于人類免疫缺陷病毒(HIV),能感染分裂期與非分裂期細胞,還具有可容載較大基因片段、目的基因穩(wěn)定持久表達、誘發(fā)宿主免疫反應率低等特點,因此慢病毒成為了攜帶干擾RNA 的理想載體[27]。 慢病毒載體介導的RNAi 技術,將基因干擾技術與慢病毒結合起來,特異性抑制基因的表達,現(xiàn)在已被廣泛應用于基因工程[28-29]。 目前針對Sirt3 基因干擾及過表達的慢病毒載體構建的已有報道,但Sirt3 基因穩(wěn)定干擾的人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 細胞株建立的詳細方法及驗證未見報道。

本實驗中我們首先利用RNAi 設計軟件按照RNA 干擾序列設計原則,設計合成4 條干擾序列及1 個陰性對照序列,然后將其分別與慢病毒載體連接。 通過對重組干擾慢病毒陽性克隆進行DNA 測序,結果提示插入的siRNA 核苷酸序列是正確的,表明我們成功構建了4 個沉默Sirt3 基因的慢病毒載體。 然后將重組慢病毒質粒與包裝質粒共轉染293T 細胞進行包裝、測定滴度,從而獲得了Sirt3 基因干擾慢病毒載體。 并將慢病毒載體感染 SHSY5Y 細胞,利用 Real-time PCR 及 Western blot 方法檢測了Sirt3 的基因及蛋白表達情況,結果發(fā)現(xiàn)LVSirt3-RNAi-3 慢病毒感染組細胞內的基因表達及蛋白表達量均顯著下降,因此篩選出了有效干擾序列LV-Sirt3-RNAi-3,再次說明我們成功構建了針對Sirt3 基因的RNA 干擾慢病毒載體,最終通過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達株。 實驗中,其它設計的干擾載體并沒有使SH-SY5Y 細胞內Sirt3 的表達明顯減少,這與以往的文獻報道有差別。 但我們的實驗成功獲得了穩(wěn)定沉默Sirt3 基因的SH-SY5Y 細胞株,為后續(xù)進一步了解Sirt3 基因的生物學特性以及探討Sirt3 引起的帕金森病細胞模型中的分子生物學變化,提供了有效的工具,具有重要的實驗價值。