張靜怡鄧永寧張 萌屈秋民?

(1.河南省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,鄭州大學(xué)人民醫(yī)院,鄭州 450003;2.西安交通大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,西安 710061)

隨著全球人口老齡化,衰老問(wèn)題日益突出,尋找衰老相關(guān)疾病的治療靶點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。Sirtuin 家族是一種線(xiàn)粒體NAD 依賴(lài)的去乙酰化酶,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)Sirtuin 家族七個(gè)成員(Sirt1-Sirt7)與衰老相關(guān)疾病密切相關(guān)[1-2]。Sirt3 主要位于線(xiàn)粒體內(nèi),研究發(fā)現(xiàn)它通過(guò)改善線(xiàn)粒體功能、減輕氧化應(yīng)激、增加三磷酸腺苷(ATP)生成、抑制凋亡等機(jī)制,在衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3-5]。 帕金森病作為第二大神經(jīng)退行性疾病,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量并且威脅著患者的生命,給社會(huì)增加了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 帕金森病的發(fā)病機(jī)制包括線(xiàn)粒體功能障礙、氧化應(yīng)激等[6],所以Sirt3 在其中的作用研究受到關(guān)注。 本實(shí)驗(yàn)利用基因干擾RNAi(RNA interference)技術(shù),擬構(gòu)建含有RNAi 片段的慢病毒載體,抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞中Sirt3 基因的表達(dá)。 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞具有多巴胺能神經(jīng)元的特性,是帕金森病體外細(xì)胞模型中常用的細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建穩(wěn)定沉默Sirt3 基因表達(dá)的細(xì)胞株,為后續(xù)研究Sirt3 在帕金森病細(xì)胞模型中的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)ATCC;293T 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 主要試劑與儀器

GV248 載體、pHelper 1.0 載體,pHelper 2.0 載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司;PCR 用試劑primer(R&F)、dsDNA oligo 均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN 公司;Lipofectamine 2000 購(gòu)自 Invitrogen;SYBR Real-time PCR 試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司;RNA 提取試劑盒購(gòu)自飛捷生物公司;胎牛血清、胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自Hyclone, USA;Western blot 制膠試劑盒購(gòu)自西安先鋒生物科技有限公司;β-actin 鼠抗單克隆抗體及 HRP 標(biāo)記山羊抗兔 IgG(sc-2005)購(gòu)買(mǎi)于Santa Cruz, USA;Sirt3 兔抗多克隆抗體購(gòu)買(mǎi)于Abcams,UK;二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Election,USA);高速臺(tái)式離心機(jī)(上海市安亭科學(xué)儀器廠(chǎng));PCR 儀(Applied Biosystems);生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司);熒光顯微鏡(Nikon, Tokyo,Japan)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNAi 慢病毒載體的制備

(1)siRNA 的設(shè)計(jì)合成

利用RNAi 設(shè)計(jì)軟件按照RNA 干擾序列設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)合成4 條針對(duì)人Sirt3 基因(GenBank:NM_004612)的siRNA 干擾序列和1 條陰性對(duì)照序列,4 條 siRNA 序 列 分 別 為: SIRT3-RNAi-1 ∶5’-ACCTGCACAGTCTGCCAAA-3’;SIRT3-RNAi-2 ∶5’-GGCTCTACACGCAGAACAT-3’;SIRT3-RNAi-3 ∶5’-CAACGTCACTCACTACTTT-3’;SIRT3-RNAi-4 ∶5’-GGGTGCTTCAAGTGTTGTT-3’。 陰性對(duì)照序列:5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。 序列由吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司合成。 同時(shí),用BLAST 同源性分析確認(rèn)4 對(duì)干擾片段的特異性。

(2)RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)以上設(shè)計(jì)的靶序列,首先合成含各干擾序列及陰性對(duì)照的單鏈DNA oligo(見(jiàn)表1),然后退火配對(duì)產(chǎn)生雙鏈DNA,再通過(guò)T4 連接酶將DNA 片段與經(jīng)過(guò)AgeI 和EcoRI 雙酶切后的GV248 線(xiàn)性化載體(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行連接;將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,PCR 鑒定陽(yáng)性重組子,利用質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,然后送DNA 測(cè)序分析進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 Oligo 序列Table 1 Oligo sequence

1.3.2 慢病毒載體的包裝與滴度測(cè)定

(1)慢病毒載體的包裝

將重組慢病毒質(zhì)粒、pHelper 1.0 載體、pHelper 2.0 載體與Opti-MEM 混合均勻進(jìn)行稀釋,同時(shí)也將Lipofectamine 2000 試劑稀釋,然后將二者進(jìn)行混合,轉(zhuǎn)移至293T 細(xì)胞的培養(yǎng)液中;轉(zhuǎn)染8 h 后棄掉含有轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)基,PBS 液洗后加入10%血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。 收集轉(zhuǎn)染后48 h 的 293T 細(xì)胞上清液,于4℃,4000 r/min 離心10 min,除去細(xì)胞碎片,以0.45 μm 濾器過(guò)濾離心后收集病毒液。

(2)慢病毒載體的滴度測(cè)定

將293T 細(xì)胞鋪板;準(zhǔn)備8 個(gè)無(wú)菌的Ep 管,在每個(gè)管中加入90 μL 的無(wú)血清培養(yǎng)基。 然后取待測(cè)定的病毒原液10 μL 加入到第一個(gè)管中混勻,再?gòu)闹腥?0 μL 加到第二個(gè)管中,繼續(xù)相同的操作直到最后一管進(jìn)行稀釋。 將細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基吸去90 μL丟棄,然后加入等量稀釋好的病毒溶液放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 24 h 后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 4 d 后觀(guān)察熒光表達(dá)情況,病毒的滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。

1.3.3 慢病毒感染SH-SY5Y 細(xì)胞

復(fù)蘇SH-SY5Y 細(xì)胞,將細(xì)胞分為六組:空白對(duì)照組(CON)為不加入病毒液而僅僅加入普通培養(yǎng)基的細(xì)胞,陰性對(duì)照組(NC)是感染陰性對(duì)照病毒的細(xì)胞、LV-Sirt3-RNAi-1 組、LV-Sirt3-RNAi-2 組、LVSirt3-RNAi-3 組、LV-Sirt3-RNAi-4 組是分別感染了LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒的細(xì)胞。 將細(xì)胞鋪于六孔板中進(jìn)行培養(yǎng),提前進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染的預(yù)實(shí)驗(yàn)確定好MOI 值,從而據(jù)此計(jì)算加入病毒液的量。 感染3 d后在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況,若80%細(xì)胞均表達(dá)熒光則表明慢病毒感染成功。

1.3.4 Real-time PCR

收集以上6 組 SH-SY5Y 細(xì)胞,按照 RNA 提取試劑盒操作流程提取總RNA,并測(cè)定RNA 濃度。將提取的RNA 與試劑盒中的試劑配成反應(yīng)液,按照37℃、15 min,85℃、5 s,4℃反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),然后將反轉(zhuǎn)錄液按照操作流程進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)。Sirt3 引物:上游引物:5’-TCCTCCTTCC TAGCATCACA-3’, 下 游 引 物 5’-ATCATAACACC GCACTCCA-3’,以 GAPDH 為內(nèi)參,上游引物為:5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’,下游引物為:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’。 采用 2-ΔΔCt法計(jì)算Sirt3 RNA 表達(dá)水平。

1.3.5 Western blot

收集以上6 組細(xì)胞,配取裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白,然后用BCA 法測(cè)定蛋白濃度;按照Western blot 說(shuō)明書(shū)、根據(jù)目的蛋白分子量制膠,然后在膠中加入蛋白液上樣,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。 將 PVDF 膜放在PBST緩沖液中漂洗后立即用5%脫脂牛奶的封閉2 h,然后用一抗(Sirt3、內(nèi)參β-actin)、二抗進(jìn)行孵育。 PBS液充分洗膜后發(fā)光成像。

1.3.6 確定嘌呤霉素篩選最佳濃度及獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株

將SH-SY5Y 細(xì)胞鋪板培養(yǎng)24 h,吸取各孔中的細(xì)胞培養(yǎng)基,依次加入嘌呤霉素濃度為 0、2、4、6、8、10 μg/μL 的新鮮無(wú)血清的培養(yǎng)基。 每天在鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,3 ～5 d 后能夠使幾乎所有細(xì)胞死亡的最小嘌呤霉素濃度即為最佳濃度。 應(yīng)用慢病毒感染后的SH-SY5Y 細(xì)胞中加入確定濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)可以得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件錄入和分析數(shù)據(jù)。 實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,得到的計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料間進(jìn)行比較采用方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾 Sirt3 表達(dá)的 siRNA 成功插入慢病毒載體

對(duì)重組干擾慢病毒陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA 測(cè)序,結(jié)果顯示:插入的針對(duì)Sirt3 基因的siRNA 核苷酸序列正確,即構(gòu)建的干擾Sirt3 基因表達(dá)的4 種siRNA 重組慢病毒干擾載體的DNA 序列與設(shè)計(jì)的序列完全相符,結(jié)果表明成功構(gòu)建了4 個(gè)沉默Sirt3 基因的慢病毒載體。 (見(jiàn)圖1、2、3、4)

2.2 慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293T 細(xì)胞

重組慢病毒質(zhì)粒與2 種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后第2 天在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察,可以看到細(xì)胞內(nèi)發(fā)出綠色熒光(見(jiàn)圖5),收集濃縮病毒液測(cè)定病毒滴度,根據(jù)熒光細(xì)胞數(shù)計(jì)算病毒的滴度為: LV-SIRT3-RNAi-1 8 × 108TU/mL、 LV-SIRT3-RNAi-2 3×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-3 8×108TU/mL、LV-SIRT3-RNAi-4 8×108TU/mL。 這表明慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)293T 細(xì)胞,成功包裝的慢病毒載體可以用于后續(xù)的研究。

圖1 SIRT3-RNAi-1 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果Figure 1 Sequencing result of SIRT3-RNAi-1 lentiviral vetor

圖2 SIRT3-RNAi-2 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果Figure 2 Sequencing result of SIRT3-RNAi-2 lentiviral vetor

圖3 SIRT3-RNAi-3 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果Figure 3 Sequencing result of SIRT3-RNAi-3 lentiviral vetor

圖4 SIRT3-RNAi-4 慢病毒載體測(cè)序結(jié)果Figure 4 Sequencing result of SIRT3-RNAi-4 lentiviral vetor

圖5 慢病毒載體共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞24 hFigure 5 Lentiviral vectors were co-transfected into the 293T cells for 24 h

2.3 LV-Sirt3-RNAi-3 顯著抑制 Sirt3 mRNA 表達(dá)

慢病毒感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為六組。 Real-time PCR 方法檢測(cè)六組SH-SY5Y細(xì)胞中Sirt3 mRNA 表達(dá)量分別是:CON (1.0854±0.0944),NC(1.1706±0.0167),LV-Sirt3-RNAi-1 組(1.0875 ± 0.0156), LV-Sirt3-RNAi-2 組 (1.3492 ±0.0697),LV-Sirt3-RNAi-3 組(0.2630±0.0184),LVSirt3-RNAi-4 組(1.2490±0.0049)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,LV-Sirt3-RNAi-3 組的 SH-SY5Y 細(xì)胞中Sirt3 mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 (見(jiàn)圖6)

2.4 LV-Sirt3-RNAi-3 顯著抑制Sirt3 蛋白表達(dá)

六組 SH-SY5Y 細(xì)胞中 Sirt3 蛋白表達(dá)量分別是:CON 組 (0.4038 ± 0.0355),NC 組 (0.4638 ±0.0411),LV-Sirt3-RNAi-1 組(0.4533±0.0750),LVSirt3-RNAi-2 組(0.5491±0.0683),LV-Sirt3-RNAi-3組(0.1633±0.0132),LV-Sirt3-RNAi-4 組(0.5167±0.0416)。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果提示LV-Sirt3-RNAi-3 組的SH-SY5Y 細(xì)胞中Sirt3 蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。 (見(jiàn)圖7)

注:CON 組代表沒(méi)有感染病毒的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Sirt3 mRNA表達(dá)量,其余五組依次代表SH-SY5Y 細(xì)胞感染陰性對(duì)照病毒(NC)、 LV-Sirt3-RNAi-1、 LV-Sirt3-RNAi-2、 LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后細(xì)胞內(nèi) Sirt3 mRNA 的表達(dá)量。 與空白對(duì)照組(CON)相比,?P<0.001;與陰性對(duì)照組相比,#P<0.001。圖6 各組慢病毒感染SH-SY5Y 細(xì)胞后Sirt3 mRNA 的表達(dá)Note.CON group bar shows Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 mRNA expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LVSirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group, ?P<0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 6 Sirt3 mRNA expression in different cells infected by corresponding lentivirus

2.5 LV-Sirt3-RNAi-3 轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光

加入嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)株通過(guò)嘌呤霉素濃度確定實(shí)驗(yàn),2 μg/μL 含有嘌呤霉素培養(yǎng)基為最佳濃度。 在LV-Sirt3-RNAi-3 組細(xì)胞中加入嘌呤霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)株。在熒光顯微鏡下觀(guān)察,通過(guò)可見(jiàn)光視野與熒光視野對(duì)比, 可見(jiàn) 90% 以上細(xì)胞均可見(jiàn)綠色熒光。(見(jiàn)圖8)

注:左圖為Western blot 代表圖,β-actin 為內(nèi)參;右圖為Sirt3的相對(duì)表達(dá)量,CON 組代表沒(méi)有感染病毒的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Sirt3 蛋白表達(dá)量,其余五組依次代表SH-SY5Y 細(xì)胞感染陰性對(duì)照病毒(NC)、LV-Sirt3-RNAi-1、LV-Sirt3-RNAi-2、LV-Sirt3-RNAi-3、LV-Sirt3-RNAi-4 慢病毒后細(xì)胞內(nèi) Sirt3 蛋白的表達(dá)量。 與空白對(duì)照組(CON)相比,?P<0.001;與陰性對(duì)照組相比,#P<0.001。圖7 各組慢病毒感染SH-SY5Y細(xì)胞后Sirt3 蛋白表達(dá)Note.Left graph shows Western blot images, β-actin was used as a loading control.Right bar graph shows relative expression of Sirt3.CON group bar shows Sirt3 protein expression in SHSY5Y cells untreated with lentivirus, the other five groups of bars show Sirt3 protein expression in SH-SY5Y cells infected by negative control lentivirus, LV-Sirt3-RNAi-1, LV-Sirt3-RNAi-2, LV-Sirt3-RNAi-3, LV-Sirt3-RNAi-4 lentivirus.Compared with CON group,?P < 0.001.Compared with NC group, #P<0.001.Figure 7 Sirt3 protein expression in different cells infected by corresponding lentivirus

3 討論

Sirt3 基因定位在11 號(hào)染色體(11p15.5)上,主要存在于腎、心臟、腦、棕色脂肪等代謝活躍的組織中[7]。 早期對(duì)Sirt3 基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn),Sirt3 基因外顯子3 上G447T 堿基顛換與老年男性長(zhǎng)壽有著緊密聯(lián)系[8]。 也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)節(jié)食(熱量限制) 延緩動(dòng)物衰老進(jìn)程的機(jī)制可能是激活了Sirt3[9]。 后來(lái)的大量針對(duì)Sirt3 的生物功能研究,證實(shí)了Sirt3 作為一種去乙?；?可以通過(guò)去乙?；L(zhǎng)鏈乙酰脫氫酶( LCAD)、 AceCS2 ( acetyl-CoAsynthetase II)酶、異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)等調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的能量代謝平衡[10],Sirt3 還通過(guò)去乙酰化MnSOD、SOD2 等并增加其活性從而減少氧化應(yīng)激損傷[11],此外Sirt3 可以減少活性氧介導(dǎo)的線(xiàn)粒體DNA 損傷[12]。 這些研究讓人們意識(shí)到Sirt3 在衰老、腫瘤等疾病中的潛在作用[13]。 近年來(lái),Sirt3 在神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病、亨廷頓病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等疾病的研究中,均證實(shí)了Sirt3 的神經(jīng)保護(hù)作用[14-16]。 帕金森病是老年人常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死及殘存的神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體為主要病理特點(diǎn)[17]。 目前對(duì)帕金森病的發(fā)病機(jī)制研究認(rèn)為,主要是線(xiàn)粒體功能障礙、氧化應(yīng)激損傷增加、α-Synuclein 蛋白的異常沉積以及三者之間的相關(guān)影響[18-20]。 在MPTP 誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型中發(fā)現(xiàn),中腦組織Sirt3 的表達(dá)量減少,且Sirt3 的減少加劇了黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的退化[21]。 實(shí)驗(yàn)研究表明,褪黑激素通過(guò)上調(diào)Sirt3 表達(dá)抵抗PD多巴胺能神經(jīng)元損傷,作用機(jī)制與其抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活減輕氧化應(yīng)激和炎癥損傷有關(guān)[22]。 柴胡皂甙d 對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y 細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用,且機(jī)制可能為上調(diào)Sirt3 的表達(dá)水平[23]。 另有研究發(fā)現(xiàn)嘌呤生物堿Theacrine 通過(guò)激活線(xiàn)粒體Sirt3,抑制ROS 生成,最終抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[24]。 馬振凱等作者實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),姜黃素可降低SH-SY5Y 細(xì)胞 ROS 水平,上調(diào)Sirt3 表達(dá)[25]。 以上結(jié)果提示,Sirt3 與PD 發(fā)生具有一定的關(guān)系,但關(guān)于Sirt3 在PD 發(fā)展中具體作用分子機(jī)制的研究,還不夠深入。

RNA 干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù),通過(guò)導(dǎo)入與靶基因mRNA 序列具有同源性的雙鏈RNA,誘導(dǎo)同源靶基因mRNA 的降解,從而沉默該基因表達(dá)[26]。 慢病毒來(lái)源于人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV),能感染分裂期與非分裂期細(xì)胞,還具有可容載較大基因片段、目的基因穩(wěn)定持久表達(dá)、誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)率低等特點(diǎn),因此慢病毒成為了攜帶干擾RNA 的理想載體[27]。 慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi 技術(shù),將基因干擾技術(shù)與慢病毒結(jié)合起來(lái),特異性抑制基因的表達(dá),現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于基因工程[28-29]。 目前針對(duì)Sirt3 基因干擾及過(guò)表達(dá)的慢病毒載體構(gòu)建的已有報(bào)道,但Sirt3 基因穩(wěn)定干擾的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 細(xì)胞株建立的詳細(xì)方法及驗(yàn)證未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)中我們首先利用RNAi 設(shè)計(jì)軟件按照RNA 干擾序列設(shè)計(jì)原則,設(shè)計(jì)合成4 條干擾序列及1 個(gè)陰性對(duì)照序列,然后將其分別與慢病毒載體連接。 通過(guò)對(duì)重組干擾慢病毒陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA 測(cè)序,結(jié)果提示插入的siRNA 核苷酸序列是正確的,表明我們成功構(gòu)建了4 個(gè)沉默Sirt3 基因的慢病毒載體。 然后將重組慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞進(jìn)行包裝、測(cè)定滴度,從而獲得了Sirt3 基因干擾慢病毒載體。 并將慢病毒載體感染 SHSY5Y 細(xì)胞,利用 Real-time PCR 及 Western blot 方法檢測(cè)了Sirt3 的基因及蛋白表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LVSirt3-RNAi-3 慢病毒感染組細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)量均顯著下降,因此篩選出了有效干擾序列LV-Sirt3-RNAi-3,再次說(shuō)明我們成功構(gòu)建了針對(duì)Sirt3 基因的RNA 干擾慢病毒載體,最終通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)株。 實(shí)驗(yàn)中,其它設(shè)計(jì)的干擾載體并沒(méi)有使SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Sirt3 的表達(dá)明顯減少,這與以往的文獻(xiàn)報(bào)道有差別。 但我們的實(shí)驗(yàn)成功獲得了穩(wěn)定沉默Sirt3 基因的SH-SY5Y 細(xì)胞株,為后續(xù)進(jìn)一步了解Sirt3 基因的生物學(xué)特性以及探討Sirt3 引起的帕金森病細(xì)胞模型中的分子生物學(xué)變化,提供了有效的工具,具有重要的實(shí)驗(yàn)價(jià)值。