杜國(guó)慧劉博偉尹福在齊曦明范冬梅

(1.承德醫(yī)學(xué)院,河北承德 067000; 2.河北省秦皇島市第一醫(yī)院內(nèi)分泌二科,河北 秦皇島 066000;3.河北省秦皇島市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,河北秦皇島 066000)

糖尿病作為慢性代謝性疾病,隨其發(fā)病率的飆升[1],已越來(lái)越受人們的關(guān)注,其發(fā)病病理生理機(jī)制主要表現(xiàn)在胰島素的缺乏和胰島素抵抗兩個(gè)方面。 其中肝的胰島素抵抗與2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān),肝糖代謝的紊亂主要通過(guò)肝糖原合成及糖異生來(lái)影響葡萄糖代謝。 CUL4a—DDB1 連接酶復(fù)合物是一類E3 泛素連接酶復(fù)合物,可以通過(guò)對(duì)底物進(jìn)行泛素化修飾,從而改變蛋白功能或促進(jìn)被修飾蛋白的降解,DNA 損傷結(jié)合蛋白1(DDB1)是DDB1- cul4a 連接酶復(fù)合物的支架組分[2-4]。

本課題旨在探討GLP-1 受體激動(dòng)劑利拉魯肽對(duì)糖尿病小鼠肝E3 泛素蛋白酶DDB1 及肝糖異生的影響及可能的機(jī)制,為 GLP-1 受體激動(dòng)劑在T2DM 等代謝性疾病治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí),雄性 KK-Ay 糖尿病小鼠 10 只,11 ～ 12周,體重為33～35 g;SPF 級(jí),雄性 C57 小鼠 5 只 11～12 周,體重為26～28 g,均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2019-0008],實(shí)驗(yàn)在天津南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫實(shí)驗(yàn)組[SYXK(津)2017-00005]進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津南開(kāi)大學(xué)倫理管理委員會(huì)審核(201907-001),對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有處置均按國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定執(zhí)行,并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

利拉魯肽注射液購(gòu)自諾和諾德制藥有限公司;RIPA 裂 解 液、 PMSF、 SDS-PAGE 制 膠 盒、 TBS(20X)、TRIS Base、Glycine、SDS(十二烷基磺酸鈉)、Tween20、脫脂奶粉(Skim Milk)均購(gòu)自索萊寶科技(Solarbio);BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)Beyotime Biotechnology 公司;ECL 顯影液、PVDF 膜購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司; Anti-mouse IgG-HRP antibody、Anti-Rabbit IgG-HRP antibody 購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Anti-IgG-DDB1 antibody購(gòu) 自 Abcam; Anti-IgG-G6pase antibody、 Anti-IgGPEPCK antibody 購(gòu)自博奧森( Bioss); Anti-Cryptochrome I/CRY1 Antibody、Anti-FoxO1a Rabbit Monoclonal Antibody 購(gòu)自博士德;SDS-Loading Buffer(5×)購(gòu)自北京康潤(rùn)科技(Genstar);葡萄糖氧化酶試劑盒購(gòu)自上海榮盛。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

取11～12 周雄性KK-Ay 糖尿病小鼠10 只,單籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境,溫度:20℃～22℃,濕度:45%～55%,光照:12 h/12 h 明暗循環(huán),所有小鼠均予以常規(guī)飲食。 小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后測(cè)量體重(35.04±0.92)g,血糖>13.9 mmol/L 的 KK-Ay 小鼠隨機(jī)分為2 組,即利拉魯肽干預(yù)組和模型對(duì)照組,每組5只。 另取同周齡體重(28.02±2.04)的雄性 C57 小鼠5 只作為正常對(duì)照,利拉魯肽干預(yù)組每日腹腔注射250 μg/kg利拉魯肽,模型對(duì)照組和正常對(duì)照組每日腹腔注射等量生理鹽水,給藥時(shí)間每日16:00 ～17:00,連續(xù)干預(yù)8 周。

1.3.2 動(dòng)物處理與取樣

在處死小鼠前,禁食12 h,對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶取血;取出眼眶血放于EP 管中,然后將EP 管置于37℃水浴鍋孵育30 min;3000 r/min 離心10 min;取上清液(即血清)轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)標(biāo)記新的1.5 mL 離心管中;采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血糖。 同時(shí)處死小鼠剖腹取小鼠肝組織分裝置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 Western blot 檢測(cè)

取0.2 g 肝組織,加入提前配好的RIPA 裂解液800 μL(RIPA 裂解液+蛋白酶抑制劑2%+磷酸酶抑制劑1%+PMSF 1%),超聲波裂解肝組織,冰上靜置30 min,12000 r/min 離心 30 min,取上清。 應(yīng)用BCA 法創(chuàng)建蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)定量,計(jì)算各肝標(biāo)本中的總蛋白和蛋白濃度。 應(yīng)用10% SDSPAGE 分離膠膠對(duì)蛋白電泳分離約1.0 ～1.5 h,在冰浴條件下轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))約120 min。 用5%脫脂奶粉溶液室溫下封閉2 h。 一抗(依據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)及摸索的具體情況確定稀釋比例,用1×TBST 稀釋)4℃條件下?lián)u床孵育過(guò)夜。 第2 天將PVDF 膜用1×TBST 洗滌5 次,每次6 min,二抗(依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求的稀釋比例,應(yīng)用1×TBST 稀釋)室溫孵育2 h,洗滌后在多功能成像儀暗室中曝光、成像、記錄圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Image J 軟件測(cè)定每個(gè)目標(biāo)條帶的灰度值,使用Graphpad 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn),以P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)隨機(jī)血糖的影響

三組小鼠血糖值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,模型對(duì)照組血糖值(30.84±1.29)mmol/L 較正常對(duì)照組血糖值(8.88±0.47)mmol/L 明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);利拉魯肽干預(yù)組血糖值(23.74±2.74)mmol/L 較模型對(duì)照組明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 對(duì)肝組織E3 泛素蛋白酶DDB1 表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示糖尿病小鼠肝內(nèi)E3 泛素蛋白酶DDB1 蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),經(jīng)利拉魯肽干預(yù)處理后,糖尿病小鼠肝內(nèi)DDB1,CRY1 的表達(dá)均低于糖尿病對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。

2.3 對(duì)小鼠肝組織CRY1、FOXO1, 及糖異生關(guān)鍵酶PEPCK、G6pase 表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示糖尿病小鼠肝內(nèi)FOXO1,PEPCK 及G6pase 蛋白水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05),經(jīng)利拉魯肽干預(yù)后,糖尿病小鼠肝內(nèi)FOXO1,PEPCK 及G6pase 的表達(dá)均明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)圖2,表2。 糖尿病小鼠內(nèi)CRY1 蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05),利拉魯肽干預(yù)處理后,表達(dá)量卻明顯上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖2、表2。

圖1 利拉魯肽對(duì)糖尿病小鼠肝E3 泛素蛋白酶DDB1蛋白表達(dá)水平的比較Figure 1 Comparison of the expression level of E3 ubiquitin protease DDB1 in liver of diabetic mice with 1iraglutide

3 討論

胰高血糖素樣肽-1(glucagon like peptide-1,GLP-1)主要由末端空腸、回腸和結(jié)腸中的 L 細(xì)胞受到食物刺激后分泌[5],是一種腸內(nèi)分泌源性肽,通過(guò)刺激胰島素分泌、抑制胰高血糖素釋放、促進(jìn)β細(xì)胞增殖、減少食物攝入等途徑,起到抑制糖尿病的作用[6],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床,主要用于改善2型糖尿病患者的胰島素敏感性。 各項(xiàng)臨床研究及meta 分析都指出:GLP-1 及其類似物能夠顯著降低2 型糖尿病患者的血糖及體重,改善胰島素的敏感性,可以改善心衰大鼠左心室的收縮和舒張功能袁減輕心肌細(xì)胞的損傷,且獨(dú)立于降糖機(jī)制[7]。 其中利拉魯肽(1iraglutide)屬于長(zhǎng)效的 GLP-1 類似物,與人體天然的GLP-1 氨基酸序列具有97%的同源性,于2010 年由美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于臨床,而目前主要用于改善成人2 型糖尿病患者的血糖控制[8],本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型對(duì)照組較正常對(duì)照組血糖明顯升高,而利拉魯肽干預(yù)后,血糖明顯下降,并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 5 組小鼠肝組織E3 泛素蛋白酶DDB1蛋白表達(dá)水平的比較Table 1 Comparison of the expression level of E3 ubiquitin protease DDB1 in liver tissues of five groups

圖2 利拉魯肽對(duì)小鼠肝CRY1、FOXO1 及PEPCK、G6pase 蛋白表達(dá)水平的影響Figure 2 Effect of Lilarutin on CRY1、FOXO1 and PEPCK、G6pase expression in mouse liver

表2 5 組小鼠肝組織 CRY1、FOXO1、G6pase、PEPCK 蛋白表達(dá)水平的比較Table 2 Comparison of protein expression levels of CRY1, FOXO1, G6pase and PEPCK in five groups mouse liver

泛素-蛋白酶體途徑(UPS)是存在于真核細(xì)胞中精確調(diào)控細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)有序降解的途徑,由泛素(Ub)、 泛素激活酶(E1)、 泛素結(jié)合酶(E2)、 泛素連接酶(E3)、26S 蛋白酶體和去泛素化酶(DUBs)組成[9]。 越來(lái)越多的研究證據(jù)表明E3泛素蛋白酶通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵分子在胰島素抵抗的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[10]:MG53的過(guò)度表達(dá)可以觸發(fā)肌肉胰島素抵抗和代謝綜合征[11-12];膜相關(guān)環(huán)-CH-1(MARCH1)可以通過(guò)泛素化負(fù)調(diào)節(jié)胰島素受體的細(xì)胞表面水平[13];也有報(bào)道稱脂肪組織E3 泛素蛋白酶Pellino3 對(duì)胰島素抵抗卻表現(xiàn)出保護(hù)作用[14]。 Xin 等人的研究表明,E3 泛素蛋白連接酶DDB1 可能是一種新型的糖原異生監(jiān)管因素,它主要通過(guò)介導(dǎo)CRY1 蛋白的降解,進(jìn)而推動(dòng)FOXO1 介導(dǎo)的糖異生作用,同時(shí)也證實(shí)肝細(xì)胞DDB1 缺乏不僅抑制空腹時(shí)糖原異生,并且可以保護(hù)小鼠免受禁食高脂肪飲食引起的高血糖[15-16]。本研究結(jié)果顯示利拉魯肽在肝內(nèi)可作用于E3 泛素蛋白酶DDB1,并下調(diào)它的表達(dá),提示 GLP-1 及其類似物在肝內(nèi)可能通過(guò)下調(diào)E3 泛素蛋白酶,進(jìn)而發(fā)揮抑制肝糖異生的作用,而其中的具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

肝是糖脂代謝的重要器官,在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[17]。 在糖尿病患者中,肝糖異生增加導(dǎo)致大量?jī)?nèi)源性葡萄糖產(chǎn)生,特別是增加了空腹高血糖的發(fā)生[18],其中糖異生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)編碼基因的多少是決定糖異生啟動(dòng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19],故通過(guò)干預(yù)肝糖異生, 減少肝葡萄糖生成, 將為改善肝胰島素抵抗提供一個(gè)廣闊前景。而肝糖異生還受很多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,包括叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子 O1(FoxO1)、CREB、 PGC-1α 等等,其中FOXO1 被證實(shí)是肝用來(lái)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)和葡萄糖代謝與循環(huán)胰島素水平的傳感器,是肝糖異生關(guān)鍵酶調(diào)控的上游靶點(diǎn),主要促進(jìn)空腹時(shí)肝糖異生, 增加肝糖輸出[20-21]。 Fan 等人[22]發(fā)現(xiàn) exendin-4 可增加幼鼠肝AKT 和FOXO1 磷酸化,抑制葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)的表達(dá)。 在本次研究中同樣證實(shí)利拉魯肽下調(diào)了肝糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 及G6pase 的表達(dá),糖異生的上游靶點(diǎn)FOXO1 的表達(dá)也同樣被下調(diào),推測(cè)利拉魯肽抑制肝糖異生可能與部分下調(diào)E3 泛素蛋白酶進(jìn)而抑制FOXO1 有關(guān),而其中的具體機(jī)制需要進(jìn)一步去驗(yàn)證。

隱花色素1(cryptochrome 1,CRY1)表達(dá)蛋白是生物鐘的組成部分,經(jīng)體液和神經(jīng)途徑送達(dá)效應(yīng)器,調(diào)節(jié)生理、生化和節(jié)律行為,肝糖異生也受晝夜節(jié)律的調(diào)控,晝夜節(jié)律是協(xié)調(diào)葡萄糖代謝與外部環(huán)境變化,研究發(fā)現(xiàn)CRY1 可以通過(guò)作用于糖皮質(zhì)激素受體和胰高血糖素信號(hào)通路負(fù)調(diào)控FOXO1 的表達(dá),抑制肝糖異生[23-25], Stojkovic 等[26]人提出泛素化是一個(gè)時(shí)鐘蛋白修飾編碼的關(guān)鍵因素,本研究發(fā)現(xiàn)肝中CRY1 的表達(dá)與DDB1 呈負(fù)相關(guān),這與之前研究結(jié)果是相符的,故推測(cè)CRY1 在肝可能是通過(guò)泛素蛋白的泛素化來(lái)降解的,進(jìn)而抑制肝糖異生,但其中的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

總之,利拉魯肽降低糖尿病小鼠糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 及G6pase 的表達(dá),抑制了肝的糖異生,有效控制糖尿病小鼠血糖。 同時(shí)利拉魯肽可顯著下調(diào)糖尿病小鼠肝內(nèi)E3 泛素蛋白酶DDB1 的表達(dá)水平,揭示了利拉魯肽調(diào)節(jié)肝糖異生可能存在的一種新的通路,這同時(shí)也揭示了E3 泛素蛋白酶可能成為一種新的肝糖異生的負(fù)調(diào)控因子,有望成為治療2型糖尿病的新的靶點(diǎn)。