劉日旭，王 乙，曹 巖，劉明開

(大連大學附屬新華醫(yī)院 檢驗科，遼寧 大連116021)

MicroRNA(miRNA)是一種參與轉錄后的基因表達水平調控的內源性非編碼小RNA分子,研究發(fā)現，存在于癌癥相關基因組區(qū)域的脆性位點中的miRNA被異常激活后可轉變?yōu)樵┗?，誘導細胞癌變的發(fā)生[1]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)基因家族，包括PIK3CA、AKT和PTEN，是人類各種癌癥中最常見的突變基因之一。PI3K途徑突變可以直接增強PIK3CA和AKT的信號傳導，也可以通過使PTEN調節(jié)因子失活的負性調控來增強信號傳導。目前腫瘤治療的新策略正在圍繞PI3K-AKT信號通路中重要分子及其靶基因進行研究[2]。本研究采用實時熒光定量PCR(qPCR)技術對MicroRNA-21-5p(miR-21-5p)和MicroRNA-18b-5p(miR-18-5p)在大腸組織中的表達水平進行檢測，并應用免疫組織化學方法對PI3K在大腸組織中的表達水平進行檢測，探討mir-21-5p和mir-18-5p在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究mir-21-5p和mir-18-5p對PI3K/AKT信號通路及其靶基因的調控作用。

1 材料與方法

1.1 病例資料

50例病例均為2018年1-9月經臨床及組織病理學檢查確診為原發(fā)性大腸癌的住院患者。其中男性27例，女性23例，平均年齡61.9歲。

1.2 標本來源

病變組(CRC)為大腸癌組織，對照組(NCM)為距腫瘤邊緣超過8 cm的癌旁正常黏膜組織。收集術中新鮮組織標本，用于qPCR檢測的置于液氮保存；用于免疫組化檢測的經過10%甲醛固定后石蠟包埋保存。

1.3 方法

1.3.1qPCR方法對大腸組織標本進行miR-21-5p和miR-18-5p相對表達量的分析 RNA提取試劑RNAiso Plus Reagent、U6引物、miR-21-5p引物、miR-18-5p引物、RT試劑盒和qPCR試劑盒，來源于大連TaKaRa公司。計算并評價RNA純度使用 Thermo NanoDrop 1000超微量分光光度計測定RNA在260 nm、280 nm的吸收值。檢測RNA純度及完整性使用變性瓊脂糖凝膠電泳。RT反應使用TaKaRa TP600型梯度PCR儀。qPCR反應使用TaKaRa TP800型實時熒光定量PCR儀。

按照RNAiso Plus Reagent試劑盒說明書，進行大腸癌組織及癌旁組織Total RNA的提取。將Total RNA 10ng作為模板，進行逆轉錄cDNA的合成。用無菌超純水稀釋cDNA 10倍后，以U6引物為內參，進行qPCR反應，檢測miR-21-5p和miR-18-5p的相對含量。RT反應條件:37℃，60 min；85℃，5 min。qPCR反應條件:95℃，預變性10 min；95℃，變性10 s；60℃，退火20 s；72℃，延伸30 s，共40個循環(huán),計算病變組和對照組的miR-21-5p和miR-18-5p的相對表達水平采用2-△CT法(△CT=CT目的基因-CTU6)。

1.3.2免疫組化法檢測組織標本中PI3K 的表達 小鼠抗人PI3K單克隆抗體來源于SANTA CRUZ公司；免疫組化試劑盒來源于福州邁新生物。標本組織以4-5 μm厚度連續(xù)切片，脫蠟水化后按試劑盒說明書進行染色，以已知的大腸癌陽性組織切片為陽性對照，PBS液代替一抗為陰性對照。

標準及判讀：參照文獻方法觀察PI3K的分布和陽性率。細胞胞質呈棕黃色為PI3K的陽性表達。計數高倍鏡下4個不同視野200個細胞，以陽性細胞的百分比為最終結果。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行數據整理和統(tǒng)計。檢測數據用均值±標準差表示。兩組間比較采用t檢驗，P<0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR實驗的結果電泳結果顯示如圖1，OD檢測結果顯示，A260 nm/A280 nm的比值為1.98，在1.8-2.1范圍內，符合qPCR檢測的要求。

圖1 RNA瓊脂糖電泳結果

2.2 miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中的表達qPCR統(tǒng)計結果表明，在50例配對組織標本中，miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織中表達水平顯著高于在癌旁正常黏膜組織中的表達水平，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織和癌旁正常黏膜組織的表達水平

2.3 免疫組化實驗的結果

免疫組化檢測結果表明，在50例大腸癌組織中，PI3K陽性細胞呈彌漫性分布，并多數聚集成團(圖2)，其陽性表達率為80.3%±1.47%。在50例癌旁正常黏膜組織中，PI3K陽性細胞呈局限性分布于大腸黏膜腺體間質中，呈現散在陽性(圖3)，其陽性表達率為11.11%±0.69%。PI3K陽性細胞的分布范圍和反應強度在大腸癌組織中均明顯高于癌旁正常黏膜組織(P<0.05)。

2.4 大腸癌組織中miR-21-5p和miR-18-5p與PI3K表達的相關性

統(tǒng)計學分析表明，大腸癌組織中的miR-21-5p與PI3K表達水平明顯正相關(r=0.810,P<0.05)；miR-18-5p與PI3K表達水平明顯正相關(r=0.790，P<0.05)。

圖2 PI3K在大腸癌組織的表達(SP×400)

圖3 PI3K在癌旁正常黏膜組織的表達(SP×400)

3 討論

近年來，隨著精準醫(yī)學概念的興起，分子生物學檢測成為腫瘤診斷和治療的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現，多種miRNA在大腸癌患者組織、血漿和糞便中的表達明顯失衡[3-5]，通過檢測異常表達的miRNA，不僅有助于腫瘤的早期篩查，更有助于疾病分型、監(jiān)測、預后評估及指導用藥[6]。miR-21-5p在腸癌組織中表達水平明顯升高，并可以通過持續(xù)活化PI3K通路，調節(jié)腫瘤細胞的增殖、侵襲[7]。TOIYAMA等人發(fā)現miR-21-5p在大腸癌患者血漿中表達水平顯著升高，在診斷及術后監(jiān)測方面優(yōu)于癌胚抗原(CEA)[8]。miR-18-5p與癌細胞凋亡有緊密的聯系，但是miR-18-5p對大腸癌的相關調控作用研究較少。Katayama等人研究顯示，肝癌中miR-18-5p表達水平增高。Murakami等人研究顯示，肝細胞癌分化程度與miR-18-5p表達水平負相關[9]。ZENG等研究顯示，肺癌中miR-18-5p表達水平增高[10]。由于miR-18-5p非某器官組織的特異性基因，在大腸癌中表達也有增加，可能在大腸癌的發(fā)病中起到廣泛的作用。存在于正常組織中的PI3K/AKT信號轉導通路，具有正常的信號轉導功能。生物信息學的分析顯示，miR-21-5p和miR-18-5p的靶基因為PTEN[11，12]。PTEN調節(jié)因子的負性調控使PI3K/AKT途徑的信號傳導增強導致突變。

本研究發(fā)現,miR-21-5p和miR-18-5p在大腸癌組織中的表達水平均超出癌旁正常黏膜組織數倍,同時PI3K蛋白在大腸癌組織中呈現彌漫性高表達，在大腸癌旁正常黏膜呈現局部性低表達，二者具有正相關性。結合生物信息學可以推測，大腸組織中的miR-21-5p和miR-18-5p因致癌因素的刺激而過表達，使PTEN的抑癌功能受限，PI3K/AKT信號通路持續(xù)活化，推進大腸癌的發(fā)生和發(fā)展。