張 瑜，呂周艷，李艷冰，王蕾蕾

(吉林大學第一醫(yī)院 干部病房，吉林 長春130021)

阿爾茨海默病(AD) 是一種嚴重的神經退行性疾病，并伴有進行性認知功能下降，其發(fā)病機制復雜，已經成為了一個全球性的公共健康問題[1]。目前淀粉樣蛋白假說是被廣泛接受的AD發(fā)病機制之一[2]，β-淀粉樣肽(Aβ)在人腦細胞中的持續(xù)積累是AD的核心病理改變。許多抑制Aβ的產生和促進Aβ分解的藥物被相繼開發(fā)出來，然而隨著這些靶向藥物在三期臨床試驗中的失敗[3]，尋找AD新的分子機制變得非常必要，這將有利于對AD的診斷以及新的靶點藥物的研發(fā)。

1 資料與方法

1.1 AD小鼠核心發(fā)病基因分析

搜集GEO數(shù)據(jù)庫獲取6例APP/PS1小鼠以及6例正常小鼠海馬組織進行RNA測序(GSE113141)。將全部差異表達基因應用DAVID軟件進行基因名稱轉換。然后行蛋白互作網(wǎng)絡分析，cytoHubba在線分析，按照評分篩選出分值最高的基因行miRNA預測，將預測的miRNA和GSE138382進行Venn分析，最終篩選出共同表達的miRNA，從而鎖定AD的核心發(fā)病基因。

1.2 核心基因表達量的驗證

天恩澤試劑盒提取3例APP/PS1轉基因小鼠和3例正常小鼠海馬組織的RNA，應用BaiTeke試劑盒進行RNA的逆轉錄以及實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)，驗證核心基因在轉基因小鼠以及正常小鼠海馬組織中的表達量。其中逆轉錄過程RNA總量設定為1 000 ng。

1.3 核心基因蛋白電泳

對3例APP/PS1小鼠以及3例正常小鼠海馬組織應用碧云天試劑盒提取蛋白質，BCA濃度測定后，按照4∶1的比例加入上樣緩沖液，在100℃下煮沸4 min。隨后蛋白電泳，應用索萊寶試劑盒配置濃縮膠和分離膠，80伏以及120 V的電壓下進行20 min和60 min電泳。對目標蛋白轉膜，轉膜條件為橫流300 A，50 min。5%脫脂牛奶孵育2 h后，一抗蛋白抗體孵育14 h，洗膜，二抗蛋白抗體孵育50 min，洗膜后蛋白顯影。

1.4 統(tǒng)計學方法

全部數(shù)據(jù)應用SPSS20.0進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差的形式表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義?；虿町惐磉_倍數(shù)計算采用2-ΔΔCt算法。

2 結果

2.1 高通量生物信息分析

利用二代測序技術對全部62976個基因進行檢測(圖1A)。其中存在大量的過高表達和過低表達的測序結果，均一性較差。通過limma數(shù)據(jù)包對全部數(shù)據(jù)進行矯正后，數(shù)據(jù)均一性較好(圖1B)。對矯正后的數(shù)據(jù)進一步篩選，在實驗組和對照組之間總共發(fā)現(xiàn)153個差異上調表達的基因和197個差異下調表達的基因。蛋白互作網(wǎng)絡及CytoHubba顯示Tyrobp可能是AD的核心發(fā)病基因。

2.2 miR628-5p/Tyrobp在AD小鼠表達量結果

生物信息網(wǎng)絡預測以及GSE138382共表達分析結果顯示miR628-5p可能通過直接調控Tyrobp的3’UTR影響AD小鼠的發(fā)病過程。小鼠海馬組織RNA提取結果顯示APP/PS1轉基因小鼠和正常小鼠海馬組織RNA濃度為266.1±11.3 ng/μl，287.4±9.6 ng/μl。qRT-PCR顯示miR628-5p在APP/PS1轉基因小鼠海馬組織中CT值為6.32±0.45，在正常小鼠海馬組織中CT值3.18±0.33，差異倍數(shù)為8.815(表1)，說明miR628-5p在AD小鼠中呈現(xiàn)差異性低表達，表達陽性率為100%。Tyrobp在APP/PS1轉基因小鼠海馬組織中CT值為2.73±0.23，在正常小鼠海馬組織中CT值4.56±0.43，差異倍數(shù)為3.556倍,因此Tyrobp在AD小鼠中呈現(xiàn)差異性高表達。

2.3 Tyrobp在AD小鼠蛋白表達量結果

Tyrobp蛋白在APP/PS1轉基因小鼠海馬組織中較正常小鼠海馬組織中呈現(xiàn)高表達。同時Tyrobp蛋白升高的APP/PS1轉基因小鼠海馬組織中也高表達Aβ蛋白以及APP蛋白(圖2)，說明Tyrobp蛋白和AD小鼠海馬組織退化程度呈現(xiàn)正相關。

表1 海馬組織RNA相關參數(shù)

圖1 基因芯片原始數(shù)據(jù)矯正處理

3 討論

AD是一種進行性認知功能下降的神經退行性疾病。主要的病理特征包括大量老年斑沉積、神經纖維纏結和選擇性的特定腦區(qū)如大腦皮層和海馬神經元及突觸的丟失。淀粉樣蛋白假說是被廣泛接受和認可的發(fā)病機制。因此針對Aβ的干預從而治療AD被給予了巨大的希望[4-6]。但是Aβ的干預似乎未能達到人們預想的效果，故新的AD分子發(fā)病機制以及藥物靶點需要被重新的研究。微小RNA作為非編碼RNA中的一類特殊的基因，其不具備蛋白編碼功能，但是可以調控編碼基因的轉錄和翻譯，進而參與到疾病的發(fā)生和發(fā)展中。對RNA表達量的檢測以及對應靶點的干預有望成為未來血清學檢查標志物以及藥物治療靶點。

圖2 Tyrobp在AD小鼠蛋白表達量

通過對AD的轉基因小鼠和正常小鼠海馬組織測序結果生物信息學分析，酪氨酸激酶結合蛋白(Tyrobp)可能是AD發(fā)病的核心基因。Tyrobp是一種小膠質細胞跨膜標志性多肽，與受體結合后在小膠質細胞表面形成吞噬活性區(qū)(吞噬突觸)參與免疫反應。Pottier[7]等人在2016年首次報道檢測AD患者體內Tyrobp的含量很有可能對早期AD患者具有診斷性作用。隨后二代測序的發(fā)展以及Tyrobp在動物實驗中的開展，不斷發(fā)現(xiàn)Tyrobp和AD的病理改變密切相關。Tyrobp參與的免疫反應可以介導可溶性Aβ對突觸的毒性作用，而AD中免疫反應的過度激活會導致突觸過度修剪和突觸丟失[8]。但是MA等人認為Tyrobp增高同時能夠抑制機體的免疫反應從而抑制小膠質細胞介導的細胞因子的產生和分泌[9]。雖然對于Tyrobp在AD患者發(fā)病機制的具體作用尚不清楚，但Tyrobp在AD患者體內升高是大家公認的。本文結果發(fā)現(xiàn)在AD小鼠海馬組織中Tyrobp較正常小鼠海馬組織內高表達3.556倍，說明針對Tyrobp的檢測干預很可能成為AD的血清學診療標志物。同時Aβ以及APP蛋白與Tyrobp表達趨勢一致，說明對Tyrobp 的干預可能成為延緩腦神經元退行性病變的一種手段。而進一步對與Tyrobp有結合位點的miRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，miR628-5p能夠調控Tyrobp的表達參與到AD的發(fā)病過程，但目前miR628-5p的報道較少，針對miR628-5p在AD中的作用機制仍需要探索。

綜上，本文通過對轉基因小鼠海馬組織的qRT-PCR驗證，證實miR628-5p/Tyrobp可以作為AD的早期診斷血清學標志物。并且miR628-5p和Tyrobp均在小鼠海馬組織中呈現(xiàn)差異性表達，其診斷的陽性率幾乎為100%。針對miR628-5p/Tyrobp進行靶向治療及干預有望成為AD治療的新方法。