徐 寧，鄭 瑞，毛小琴，撒亞蓮

(1.云南省第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科;2.云南省臨床檢驗(yàn)中心;3.云南省臨床微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;4.云南省第一人民醫(yī)院 臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，云南 昆明650032)

快速診斷和治療是結(jié)核病控制的關(guān)鍵問題，至今沒有一種準(zhǔn)確、快速、可靠，檢測結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核菌)感染的方法[1]。常用細(xì)菌學(xué)檢測方法，如痰涂片鏡檢法和培養(yǎng)法，以及結(jié)核菌臨床基因擴(kuò)增法、血清學(xué)檢測方法等。但這些方法存在敏感性較低、特異性較差、操作復(fù)雜，檢測周期長等問題[2]。世界衛(wèi)生組織 2014 年的報告顯示，結(jié)核病診斷率僅為37%[3]，即使在發(fā)達(dá)國家，僅有50%結(jié)核病例通過細(xì)菌學(xué)方法證實(shí)[4]。因此，開發(fā)快速特異診斷結(jié)核病的方法已經(jīng)成為控制結(jié)核病蔓延的緊迫任務(wù)。結(jié)核菌可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)，因此，檢測結(jié)核菌特異的T淋巴細(xì)胞可作為檢測感染的一種新路徑[5]。本研究對960例γ干擾素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)查分析，探討其在結(jié)核病快速診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料采用整群定點(diǎn)抽樣法，選取2019年1月至 2019年12月在云南省第一人民醫(yī)院住院的疑似結(jié)核患者為研究對象，其中男528例，女432例，年齡40-67歲，平均(49.14±17.42)歲。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) 陽性組均為云南省第一人民醫(yī)院門診及住院患者，且經(jīng)相關(guān)病理及細(xì)菌學(xué)檢查和臨床轉(zhuǎn)歸而最終證實(shí)的結(jié)核感染患者516例，其中男 288例，女 228 例，年齡 49-67歲，平均(49.14±17.81)歲。而陰性組則是疑似結(jié)核，最終通過其他檢查排除結(jié)核患者444例。其中男240例，女204例，年齡40-58歲，平均(40.86±17.04)。ATB(active tuberculosis,ATB)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：除具有典型的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)外，痰、支氣管肺泡灌洗液、組織或其他送檢標(biāo)本中MTB培養(yǎng)陽性。LTBI(latent tuberculosis infection,LTBI)的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：常規(guī)篩查中結(jié)核γ—干擾素試驗(yàn)陽性，但無結(jié)核病相關(guān)的臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)[6]

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)(任意一條滿足) (1)年齡<18歲；(2)免疫功能低下人群(糖尿病、惡性腫瘤、慢性腎功能衰竭患者)；(4)抗結(jié)核治療>2周者。

1.2 研究方法

1.2.1樣本收集與要求 住院符合條件患者入院后次日早晨空腹采樣新鮮的肝素鈉抗凝全血4 ml，室溫保存，及時送檢。同時患者檢測痰涂片，有條件者纖支鏡刷片查抗酸桿菌，肺外結(jié)核取相關(guān)部位涂片查抗酸桿菌，IGRA(結(jié)核γ—干擾素酶聯(lián)免疫法釋放試驗(yàn))及病理送檢。

1.2.2試劑與器材 采用QIAGEN 的結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞反應(yīng)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件 SPSS24.0 分析處理數(shù)據(jù)，單因素分析采用t檢驗(yàn)和方差分析，多因素分析采用logistic回歸分析,且當(dāng)P<0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。

2 結(jié)果

2.1 γ-干擾素與病理結(jié)果的關(guān)系

干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果和最終病理確診結(jié)果的比較使用配對卡方檢驗(yàn)，P值<0.001為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，干擾素試驗(yàn)結(jié)果和最終病理確診結(jié)果之間有相關(guān)。優(yōu)劣性檢驗(yàn)的雙側(cè)P值為0.290，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認(rèn)為兩種方法的測定結(jié)果有差別，證明γ干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果和病理結(jié)果有較高一致性，見表1。

表1 960例患者干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果與最終確診結(jié)果的比較

2.2 干擾素釋放量與單核細(xì)胞數(shù)量、C反應(yīng)蛋白、淋巴細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性分析

P值分別為0.991、0.542、0.000，單核細(xì)胞數(shù)量和C反應(yīng)蛋白的P值>0.05，沒有相關(guān)性。淋巴細(xì)胞數(shù)量的P值<0.05，有相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.784。

2.2.1干擾素釋放量與單核細(xì)胞數(shù)量相關(guān)分析,見圖1。

圖1 干擾素釋放量與單核細(xì)胞數(shù)量沒有相關(guān)性

2.2.2干擾素釋放量與C反應(yīng)蛋白數(shù)量相關(guān)分析，見圖2。

圖2 干擾素釋放量與C反應(yīng)蛋白數(shù)量無相關(guān)性

2.2.3干擾素釋放量與淋巴細(xì)胞數(shù)量相關(guān)分析，見圖3。

圖3 γ干擾素釋放量和淋巴細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)

2.3 干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果影響因素分析

本研究960例干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果陽性516例，干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果陰性444例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在年齡、干擾素釋放量、淋巴細(xì)胞、CRP等方面差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；而在性別、血沉方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。為了剔除混雜因素，將單因素有統(tǒng)計學(xué)意義的因素進(jìn)行多因素分析，以陽性、陰性作為應(yīng)變量，以年齡、干擾素釋放量、淋巴細(xì)胞、CRP、激素使用作為自變量納入logistic回歸分析；結(jié)果提示：5個因素都是干擾素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響因素。

表2 干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果影響因素分析

3 討論

γ-干擾素釋放試驗(yàn)(Gamma-interferon release test，IGRAs)是檢測結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)特異性抗原刺激T細(xì)胞產(chǎn)生的γ干擾素，以判斷是否存在MTB的感染。IGRAs可彌補(bǔ)PPD試驗(yàn)的不足，目前多個國家已將其用于診斷MTB潛伏感染(1atent tuberculosis infection，LTBI)，LTBI是宿主感染MTB后的一種特殊狀態(tài)，感染者體內(nèi)的MTB處于持留狀態(tài)，不能診斷為活動性結(jié)核病，但具有發(fā)展為活動性結(jié)核病的風(fēng)險。對LTBI的高危人群進(jìn)行早期診斷和適當(dāng)干預(yù)，在結(jié)核病控制中具有積極意義[7]。研究結(jié)果提示，IGRAs診斷MTB感染的特異度與病理最終結(jié)果符合性很高，與相關(guān)研究相同[8]，而對云南HIV高發(fā)地區(qū)，其中有13例HIV患者，結(jié)核是HIV感染者死亡的首要原因[9]，而IGRAs尤其是細(xì)胞檢測)受CD4+T細(xì)胞數(shù)量的影響較小，因?yàn)镮GRAs檢測過程中已對單個核細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，即在檢測程序上消除了淋巴細(xì)胞數(shù)量減少對檢測結(jié)果的影響，從而提高了其敏感性。IGRAs診斷采用MTB的RDl區(qū)基因編碼抗原多肽作為特異性抗原，主要有相對分子質(zhì)量為6000的早期分泌抗原靶(ESAT-6)和相對分子質(zhì)量為10000的培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)抗原并在此基礎(chǔ)上增加了TB7.7抗原多肽[10]。而ESAT-6和CFP-10主要存在于MTB復(fù)合群[11]，而在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中缺失，因此IGRAs的特異度較好,但在敏感性上γ干擾素存在一定的局限性[12]，特別是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病、器官移植等免疫功能受損患者及糖尿病等特殊患者[13-15]，因其自身原因，或接受糖皮質(zhì)激素或腫瘤壞死因子TNF-a拮抗劑等免疫抑制藥物治療導(dǎo)致免疫功能缺陷，病人免疫系統(tǒng)受損，致使T細(xì)胞無法產(chǎn)生γ-干擾素，而導(dǎo)致IGRAs的敏感度并未高于PPD試驗(yàn)[16]，但是這類患者是LTBI發(fā)展為結(jié)核病的高風(fēng)險人群，在臨床工作中給予IGRAs檢測結(jié)果的解釋一定要根據(jù)患者綜合因素進(jìn)行分析。

本研究重點(diǎn)關(guān)注了年齡、γ干擾素釋放量、淋巴細(xì)胞數(shù)量、C反應(yīng)蛋白、單核細(xì)胞等各種影響因素，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，非甾體抗炎類藥物[17]、T細(xì)胞活化抑制劑[18]、應(yīng)用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致白細(xì)胞總數(shù)增多，淋巴細(xì)胞減少，導(dǎo)致γ干擾素減少[19]。本研究也證實(shí)，年齡、γ-干擾素釋放量、使用激素、淋巴細(xì)胞數(shù)量、CRP五個因素P值均小于0.05，從而證實(shí)這些因子是γ干擾素試驗(yàn)的結(jié)果不確定時需要復(fù)查的確定因素。在現(xiàn)有結(jié)核診斷方法存在諸多缺陷的今天，γ干擾素結(jié)合相關(guān)影響因素判斷結(jié)核感染，可以給臨床醫(yī)師提供有力參考，指導(dǎo)臨床實(shí)踐。