王元杰，彭宏峰，董 偉，梁永強(qiáng)，董 青，張瑾瑾，馬 冬

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是口腔科最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病年輕化、預(yù)后差、復(fù)發(fā)風(fēng)險高，5年生存率仍較低[1-3]，提示早期診斷十分重要。飲酒、嚼檳榔和吸煙是OSCC發(fā)生的主要因素[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，受體型蛋白酪氨酸磷酸酶(receptor protein tyrosine phosphatase-K, PTPRK)的表達(dá)受DNA甲基化的影響并與OSCC相關(guān)，但是其表達(dá)下調(diào)所影響的下游分子仍不清楚。OSCC的發(fā)生、發(fā)展與炎癥相關(guān)[6-7]，已有報道炎癥可誘導(dǎo)活化T細(xì)胞核因子c2蛋白(nuclear factor of activated T cells c2, NFATc2)的表達(dá)和入核，進(jìn)而通過調(diào)控炎癥相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄(如IL-6和IL-11等)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[8]；在鼻型自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤中，PTPRK表達(dá)下調(diào)與NFATc2表達(dá)升高相關(guān)[9]，以及NFATc2通過上調(diào)原癌基因ETS1的表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲[10]。盡管目前在口腔癌的遺傳多態(tài)性[11]和細(xì)胞水平上已有轉(zhuǎn)錄因子NFATc2方面的研究報道[12]，但是NFATc2與PTPRK的關(guān)系及其臨床意義的研究仍顯不足。因此，本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)預(yù)測、OSCC臨床樣本、人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和OSCC細(xì)胞系SCC25進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探討NFATc2在OSCC中的表達(dá)和作用，為OSCC的早期診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1一般資料 選取2013年1月～2015年6月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科收治的57例OSCC患者，均經(jīng)病理診斷明確。其中男性34例，女性23例，年齡43～67歲，中位年齡(54.21±9.79)歲；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期19例、Ⅲ+Ⅳ期38例。另收集癌旁正?？谇火つそM織標(biāo)本41例作為對照組。兩組標(biāo)本在采集完成后迅速用生理鹽水清洗血漬，并用4%多聚甲醛固定和石蠟組織包埋以及部分樣本進(jìn)行液氮凍存。

1.1.2細(xì)胞系 人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和人OSCC細(xì)胞系SCC25，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并加鏈霉素(100 μg/mL)和青霉素(100 U/mL)，5%CO237 ℃培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)預(yù)測 DNA采用在線GeneMANIA網(wǎng)站預(yù)測與PTPRK關(guān)聯(lián)度高的基因(http://genemania.org/search/homo-sapiens/PTPRK/)。

1.2.2免疫組化 所有標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。免疫組化染色采用SP法，染色步驟嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。隨機(jī)選取5個癌巢內(nèi)的視野，通過Image-Pro Plus 6.0軟件(美國MEDIA CYBERNETIC圖像技術(shù)公司)分析棕色顆粒在整個視野內(nèi)所占百分比。

1.2.3細(xì)胞免疫熒光染色 培養(yǎng)人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和OSCC細(xì)胞系SCC25細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定8 min，0.5%Triton PBS通透2 min，10%山羊血清封閉，應(yīng)用鼠單克隆抗體NFATc2(1 ∶50，sc-7296，Santa Cruz公司)稀釋液4 ℃孵育過夜，F(xiàn)luorescein標(biāo)記的抗兔二抗(anti-PTPRK，1 ∶100稀釋，紅色)室溫孵育45 min，DAPI染核，細(xì)胞核呈藍(lán)色。熒光顯微鏡下觀察人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和OSCC細(xì)胞系SCC25中NFATc2表達(dá)的熒光強(qiáng)度和核定位情況，采用Image Pro-Plus 6.0軟件定量分析NFATc2的表達(dá)水平。結(jié)果判定：NFATc2蛋白在OSCC中的表達(dá)水平高于配對對照組織中的表達(dá)定義為高表達(dá)；在OSCC組織中的表達(dá)低于配對對照組織的表達(dá)定義為低表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 OSCC組織中NFATc2的表達(dá)采用GeneMANIA網(wǎng)站在線預(yù)測與PTPRK基因表達(dá)在分子互作、共表達(dá)、共定位和分子通路等方面相關(guān)的基因結(jié)果顯示，PTPRK與NFATc2基因關(guān)聯(lián)度高，主要表現(xiàn)在分子通路關(guān)系(圖1)；采用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了預(yù)測結(jié)果，在OSCC組織中NFATc2表達(dá)顯著升高(P<0.01)，且其表達(dá)主要定位于細(xì)胞核(圖2)。

圖1 GeneMANIA網(wǎng)站預(yù)測與PTPRK基因表達(dá)相關(guān)的基因：圓圈大小代表關(guān)聯(lián)度大小，紅色線代表相互作用，藍(lán)色線代表分子通路

圖2 口腔鱗狀細(xì)胞癌和正常對照組織中NFATc2的表達(dá)：A. 免疫組化檢測NFATc2的表達(dá)，SP法；B. 柱狀圖顯示NFATc2的表達(dá)；與對照組相比，**P<0.01

2.2 OSCC組織中PTPRK與NFATc2表達(dá)的關(guān)系免疫組化檢測OSCC組織中PTPRK的表達(dá)，其中PTPRK高表達(dá)21例，低表達(dá)36例；并將PTPRK高表達(dá)和低表達(dá)OSCC組織樣本中的NFATc2陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，在PTPRK高表達(dá)OSCC組織中NFATc2表達(dá)減少；相反，PTPRK低表達(dá)OSCC組織中NFATc2表達(dá)明顯升高[(14.8±3.2)%vs(55.9±4.4)%，P<0.01，圖3]。

圖3 口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中PTPRK與NFATc2的表達(dá)：A. 免疫組化檢測，SP法；B. 柱狀圖顯示PTPRK與NFATc2的表達(dá)；與PTPRK高表達(dá)組相比，**P<0.01

2.3 NFATc2在人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和OSCC細(xì)胞系SCC25中的表達(dá)和定位采用免疫熒光染色證實(shí)NFATc2在人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和OSCC細(xì)胞系SCC25中的表達(dá)和定位，結(jié)果顯示在HIOEC中，NFATc2表達(dá)較少且定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在SCC25中其表達(dá)升高1.89倍(P<0.001)，且其表達(dá)核定位顯著增加，提示在OSCC中NFATc2表達(dá)明顯升高，且在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)功能(圖4)。

圖4 人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞系HIOEC和口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系SCC25中NFATc2的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果：A. 紅色代表NFATc2染色結(jié)果，藍(lán)色代表DAPI細(xì)胞核染色結(jié)果； B. 柱狀圖顯示各細(xì)胞系中NFATc2的表達(dá)；與HIOEC相比，***P<0.001

2.4 NFATc2表達(dá)與OSCC臨床病理特征的關(guān)系OSCC中NFATc2表達(dá)與患者性別、年齡和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)；而與TNM分期和分化程度有關(guān)(P均<0.05，表1)。

表1 口腔鱗狀細(xì)胞癌中NFATc2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

NFAT家族蛋白最初在活化的T細(xì)胞中作為IL2的轉(zhuǎn)錄激活蛋白而鑒定得到，包含一個高度保守的REL同源區(qū)域(REL-homology domain, RHD),與DNA結(jié)合來調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，其不僅調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育和分化，而且還促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移、侵襲和新生血管形成[13-14]。目前已有報道NFATc2表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌[8]、肺癌[15]、黑色素瘤[16]、食管癌[17]和肉瘤[18]的發(fā)生、發(fā)展。

本組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[5]，PTPRK基因啟動子DNA高甲基化導(dǎo)致其表達(dá)減少在OSCC中具有重要臨床意義。本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)預(yù)測和OSCC臨床樣本及細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，PTPRK與NFATc2表達(dá)在分子通路上具有相反的關(guān)系，此結(jié)果與在胃癌和淋巴瘤中的研究結(jié)果一致。STAT3信號異常激活與OSCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[19]。Qi等[8]在表觀遺傳學(xué)變化促進(jìn)胃癌進(jìn)展的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通過組蛋白H3的絲氨酸磷酸化異常激活絲裂原和應(yīng)激激活蛋白1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1, MSK1)表達(dá)，共同形成正反饋環(huán)復(fù)合物并結(jié)合于NFATc2啟動子上激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而NFATc2蛋白表達(dá)入核并轉(zhuǎn)錄上調(diào)炎癥相關(guān)因子，即STAT3/MSK1/NFATc2信號軸在促進(jìn)炎癥和胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。與此同時，Chen等[9]在鼻型自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，PTPRK的DNA甲基化抑制其表達(dá)，解除了對STAT3的去磷酸化修飾和信號激活的抑制。因此推測，DNA甲基化介導(dǎo)的PTPRK-STAT3-NFATc2信號軸在OSCC發(fā)展進(jìn)程中具有重要作用，有望成為治療靶點(diǎn)。

通常狀態(tài)下，NFATc2以高度磷酸化修飾存在于胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到異常刺激作用時，NFATc2作為鈣調(diào)磷酸酶的底物去磷酸化，隨后入核發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控炎癥相關(guān)因子的作用[20]。盡管本實(shí)驗(yàn)并沒有檢測其磷酸化修飾狀態(tài)，但是其磷酸化修飾后的入核現(xiàn)象在OSCC組織和SCC25細(xì)胞系中均已被證實(shí)，表明其主要在細(xì)胞核中發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)的功能并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。另外，該研究結(jié)果提示，NFATc2去磷酸化修飾的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的應(yīng)用，如他克莫司(tacrolimus, FK506)或環(huán)孢素A(cyclosporine A)是否在OSCC中具有抑制腫瘤的治療作用將是本課題組今后的研究方向。最后，本實(shí)驗(yàn)從臨床角度證實(shí)了PTPRK下游NFATc2的表達(dá)上調(diào)和入核增加與OSCC病理分期和分化程度相關(guān)，提示該基因在OSCC的診斷和治療方面具有重要意義，其相關(guān)分子機(jī)制研究是課題組下一步的工作重點(diǎn)。