劉 露 馮 偉 郭軼男

(沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110031)

支氣管肺發(fā)育不良 (bronchopulmonary dysplasia, BPD) 是多發(fā)于早產(chǎn)兒的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。由于早產(chǎn)兒各器官、系統(tǒng)未完全發(fā)育，BPD的發(fā)病率隨孕齡和胎兒出生體質(zhì)量的減少而增加[1-2]。補(bǔ)充高濃度氧氣、感染、炎癥、機(jī)械通氣以及遺傳因素都是誘發(fā)BPD的重要原因[3-5]。糖皮質(zhì)激素 (Glucocorticoid, Gluc) 具有抗炎、抗過(guò)敏、免疫抑制、抗微生物毒素和抗休克等作用，可促進(jìn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞成熟和肺表面活性物質(zhì)產(chǎn)生[6-7]。有研究顯示糖皮質(zhì)激素可通過(guò)調(diào)節(jié) JAK2/STAT5 信號(hào)抑制小鼠氣道重塑平滑肌細(xì)胞的增殖作用, 而氣道重塑指氣道在炎癥刺激下發(fā)生的氣道壁增厚，細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等。JAK2/STAT5 信號(hào)通路可介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)，并參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖與分化[8-10]，因此，我們猜測(cè)JAK2/STAT5 通路的激活可能與糖皮質(zhì)激素緩解小鼠肺功能損傷有關(guān)。本研究旨在通過(guò)研究糖皮質(zhì)激素對(duì)高氧誘導(dǎo)的小鼠肺臟炎癥反應(yīng)、肺功能損傷及對(duì)JAK2/STAT5 通路的影響，為治療肺功能損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

30只新生一日齡SPF級(jí)C57BL/6 小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，許可證號(hào)[SYXK (渝) 2017-0023]；地塞米松購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自碧云天公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，IL-6、 MCP-1、 iNOS檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自Abcam公司；本研究所用抗體均購(gòu)自CST公司；引物由北京華大基因公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；PCR 儀、垂直電泳槽購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；AniRes2005 動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)購(gòu)自北京貝蘭博科技公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物處理及分組

將新生小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Hyperoxia組、低劑量 Gluc組(Hyperoxia+ 1.2 mg/kg體質(zhì)量 Gluc)、中劑量Gluc組(Hyperoxia+2.4 mg/kg體質(zhì)量 Gluc)、高劑量Gluc組(Hyperoxia+4.8 mg/kg體質(zhì)量 Gluc)，每組6只。將各組小鼠飼養(yǎng)于相同的氧箱中，對(duì)照組小鼠供應(yīng)正常空氣，造模小鼠均提供濃度 ≥ 90%的氧氣，連續(xù)飼養(yǎng)7 d。低、中、高劑量 Gluc組于造模后進(jìn)行尾靜脈注射地塞米松(1 mg/kg)，2天1次，共3次。對(duì)照組與Hyperoxia組僅需注射等體積生理鹽水即可。

1.3 肺功能檢測(cè)

使用1%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射，小鼠麻醉后行氣管切開(kāi)術(shù)。將小鼠仰臥放置于體描箱并記錄靜息呼吸狀態(tài)，連接呼吸機(jī)后連續(xù)檢測(cè)各組小鼠靜息通氣量、氣道阻力、氣道壓力、肺容積、最大吸氣流量5次，取平均值。

1.4 石蠟切片及HE染色

將各組小鼠頸椎脫臼處死后，取出肺臟浸泡于4%多聚甲醛中固定，按照常規(guī)方法制作石蠟切片。將切片在二甲苯中脫蠟，再經(jīng)梯度酒精水化。根據(jù)HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色，經(jīng)中性樹(shù)膠封固后在顯微鏡下觀(guān)察。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)肺組織的細(xì)胞凋亡

將肺組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，并按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒程序進(jìn)行操作，封片后顯微鏡下觀(guān)察。

1.6 RT-PCR檢測(cè)

Trizol法提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。β-actin引物：上游5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游5′-ATGGAGCCACC GATCCACA-3′；TGF-β引物：上游5′-ATAC GCCTGAGTGGCTGTCTTT-3′，下游5′-AAAGCCCTGTATTCCGTCTCC-3′；α-SMA引物：上游5′-GCCAAGCAC TGTCAGGAATCC-3′，下游5′-CACAATGG ATGGGAAAACAGCC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.7 Western Blot檢測(cè)

將肺組織充分勻漿，每20 mg組織加入150 μL的RIPA裂解液。蛋白上清中加入loading buffer并經(jīng)沸水加熱變性，經(jīng)電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)印蛋白質(zhì)至PVDF膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別孵育一抗、二抗，PBST洗脫后，加入BCL，進(jìn)行曝光，用ImageJ軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.8 ELISA檢測(cè)

將各組小鼠頸椎脫臼處死后，結(jié)扎靠近鼻腔端的氣管和右肺，從氣管處向右肺內(nèi)注入3 mL PBS，充分灌洗后回收支氣管肺泡灌洗液至離心管，將灌洗液1 000 r/min離心5 min，取上清。用ELISA試劑盒分別檢測(cè)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量。

1.9 白細(xì)胞計(jì)數(shù)

同上取得各組小鼠的支氣管肺泡灌洗液，將灌洗液1 000 r/min離心5 min，棄上清。取500 μL PBS重懸細(xì)胞，充分混勻后取10 μL滴加至細(xì)胞計(jì)數(shù)板，分別計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞和白細(xì)胞。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 糖皮質(zhì)激素緩解高氧誘導(dǎo)的小鼠肺功能下降

使用動(dòng)物肺功能分析系統(tǒng)檢測(cè)小鼠肺功能。如圖1所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低劑量 Gluc組中小鼠的靜息通氣量、氣道阻力、氣道壓力、肺容積、最大吸氣流量均顯著降低(P<0.05)。其次，與對(duì)照組相比，中劑量Gluc組靜息通氣量、氣道壓力、肺容積、最大吸氣流量均顯著下降 (P<0.05)，而氣道阻力無(wú)顯著變化。與Hyperoxia組相比，中、高劑量Gluc組中小鼠各肺功能指標(biāo)均顯著升高(P<0.05)。

2.2 糖皮質(zhì)激素緩解高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷

通過(guò)HE染色和TUNEL染色觀(guān)察各組小鼠肺組織形態(tài)及凋亡情況。如圖2-A所示，對(duì)照組新生小鼠肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)整，肺泡間隔無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Hyperoxia組小鼠肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)壞死細(xì)胞、炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞，肺泡間隔增寬且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；低、中、高劑量 Gluc組小鼠肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)改變程度逐漸降低。

圖1 糖皮質(zhì)激素對(duì)模型小鼠肺功能的影響

圖2 糖皮質(zhì)激素對(duì)模型小鼠肺組織形態(tài)及細(xì)胞凋亡的影響

如圖2-A和2-B所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低、中劑量Gluc組中凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著增多 (P<0.05)。與Hyperoxia組相比，中、高劑量Gluc組中細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少 (P<0.05)。由此可見(jiàn)，糖皮質(zhì)激素可以減輕高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷。

2.3 糖皮質(zhì)激素抑制高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織纖維化

通過(guò)RT-PCR、Western Blot檢測(cè)α-SMA、TGF-β表達(dá)水平。如圖3所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低、中劑量Gluc組中α-SMA， TGF-β在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量均顯著增加 (P<0.05)；與Hyperoxia組相比，中、高劑量Gluc組中α-SMA， TGF-β在mRNA和蛋白水平均顯著下降(P<0.05)。提示，糖皮質(zhì)激素可下調(diào)模型小鼠肺組織中肺纖維化標(biāo)記物α-SMA、TGF-β的表達(dá)。

2.4 糖皮質(zhì)激素緩解模型小鼠肺臟中炎癥反應(yīng)

收集小鼠支氣管肺泡灌洗液，統(tǒng)計(jì)嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞總數(shù)的百分比。如圖4-A所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低、中劑量Gluc組中嗜酸性粒細(xì)胞占比顯著升高 (P<0.05)；與Hyperoxia組相比，中、高劑量Gluc組中嗜酸性粒細(xì)胞占比均顯著下降 (P<0.05)。ELISA檢測(cè)灌洗液中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量。如圖4-B～4-D所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低、中劑量Gluc組中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量均顯著增高 (P<0.05)；與Hyperoxia組相比，中、高劑量Gluc組中IL-6、 MCP-1、 iNOS的含量均顯著下降 (P<0.05)。由此可見(jiàn)，糖皮質(zhì)激素可緩解高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織中的炎癥反應(yīng)。

通過(guò)Western Blot檢測(cè)JAK2和STAT5的磷酸化情況。如圖5所示，與對(duì)照組相比，Hyperoxia組、低、中劑量Gluc組中p-JAK2/JAK2、p-STAT5/STAT5比例均顯著增高 (P<0.05)；與Hyperoxia組相比，高劑量Gluc組中p-JAK2/JAK2、p-STAT5/STAT5比例均顯著下降 (P< 0.05)。由此可見(jiàn)，糖皮質(zhì)激素模型小鼠組織中JAK2/STAT5通路活性。

圖3 糖皮質(zhì)激素對(duì)模型小鼠肺纖維化的影響

圖4 糖皮質(zhì)激素對(duì)模型小鼠肺臟炎癥反應(yīng)的影響

圖5 糖皮質(zhì)激素對(duì)JAK2和STAT5蛋白磷酸化的影響

3 討論

目前，對(duì)于BPD的治療依舊是個(gè)難題。有報(bào)道稱(chēng)，糖皮質(zhì)激素具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克等作用。因此，糖皮質(zhì)激素有望成為BPD的治療藥物。

高氧是誘導(dǎo)肺功能損傷的重要原因。有研究表明，持續(xù)性高氧可誘導(dǎo)小鼠的肺泡容積、肺容量顯著增加，而肺泡表面積、肺微血管容量顯著減少[11]，這提示，高氧可降低功能性肺泡-毛細(xì)管氣體擴(kuò)散效率。還有研究顯示，高氧誘導(dǎo)早產(chǎn)幼兔氣道阻力和總肺活量下降，而增加肺組織彈性和組織阻尼[12]，造成肺功能低下。本研究結(jié)果顯示，高氧處理誘導(dǎo)新生小鼠靜息通氣量、氣道阻力、氣道壓力、肺容積、最大吸氣流量降低，而糖皮質(zhì)激素可緩解高氧對(duì)小鼠肺功能的影響所用。

在高氧作用下，肺臟組織發(fā)生病理性變化。有相關(guān)研究顯示，高氧導(dǎo)致早產(chǎn)幼兔肺泡數(shù)量減少且肺泡腔變大，肺泡壁增厚，遠(yuǎn)端氣道減少，且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多[13]。此外，Luan等人通過(guò)徑向肺泡計(jì)數(shù) (RAC) 評(píng)估肺泡發(fā)育程度發(fā)現(xiàn)暴露于高氧的新生小鼠肺組織中肺泡數(shù)量明顯減少，同時(shí)高氧還誘導(dǎo)I型膠原 (COL1)、MMP-9、TIMP-1、α-SMA、TGF-β的表達(dá)水平升高，促進(jìn)小鼠肺組織的纖維化[14]。肺纖維化是各種間質(zhì)性肺疾病的最終病理表現(xiàn)，而上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化在其中發(fā)揮重要作用[15]。在EMT過(guò)程中，E-鈣粘素 (E-Cadherin)表達(dá)量降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物 α-SMA 表達(dá)量增加，最終使得細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)[16-17]。在本研究中，Hyperoxia組小鼠肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)壞死細(xì)胞、紅細(xì)胞，肺泡間隔增寬且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，TUNEL染色發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡；而糖皮質(zhì)激素可以緩解高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織形態(tài)改變，并減少凋亡細(xì)胞數(shù)量。此外，糖皮質(zhì)激素可逆轉(zhuǎn)高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織中肺纖維化標(biāo)記物α-SMA， TGF-β的表達(dá)量增加，抑制肺組織的進(jìn)一步損傷。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體的正常保護(hù)性反應(yīng)，而過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)加重細(xì)胞和組織損傷。目前已有大量的研究證實(shí)高氧誘導(dǎo)的肺功能損傷與肺內(nèi)的炎癥有關(guān)。Jin等發(fā)現(xiàn)，高氧處理的早產(chǎn)小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平升高，且肺組織中細(xì)胞凋亡數(shù)量增多[18]。Kumar等發(fā)現(xiàn)，高氧誘導(dǎo)小鼠肺臟中炎癥標(biāo)志物MCP-1，IL-12，INF-γ含量增高，且肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞數(shù)量增加[19]。嗜酸性粒細(xì)胞主要存在于組織中，當(dāng)發(fā)生間質(zhì)性肺炎或支氣管哮喘等疾病時(shí)會(huì)出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞增高的現(xiàn)象[20-21]。本研究結(jié)果顯示，糖皮質(zhì)激素可以逆轉(zhuǎn)高氧誘導(dǎo)的小鼠肺臟中嗜酸性粒細(xì)胞增多和炎癥因子IL-6、 MCP-1、 iNOS含量增加，這提示糖皮質(zhì)激素可有效緩解高氧損傷所造成的肺臟炎癥反應(yīng)。

JAKS家族是一類(lèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶，而信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)可被JAK磷酸化而發(fā)生二聚化，參與基因表達(dá)調(diào)控。JAK/STAT通路是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一，參與調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多個(gè)方面[22]。有研究表明，糖皮質(zhì)激素可通過(guò)抑制JAK2/STAT5通路緩解小鼠支氣管膠原沉積、氣道重塑，并降低嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的比例[8]。而氣道重塑指氣道在炎癥刺激下發(fā)生的氣道壁增厚，細(xì)胞外基質(zhì)沉淀等。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素可以抑制高氧誘導(dǎo)的小鼠肺組織中JAK2/STAT5通路磷酸化水平升高。這提示，JAK2/STAT5通路高度磷酸化可能與高氧誘導(dǎo)的肺組織損傷及炎癥有關(guān)，而糖皮質(zhì)激素可能通過(guò)抑制該通路活性而緩解小鼠的肺損傷。

綜上所述，糖皮質(zhì)激素可緩解肺組織損傷并下調(diào)模型小鼠肺臟組織中炎癥因子含量，同時(shí)抑制JAK2/STAT5通路活性。下一步我們將深入探究JAK2/STAT5通路活性與糖皮質(zhì)激素作用的關(guān)系，進(jìn)一步探究糖皮質(zhì)激素緩解肺功能損傷的分子機(jī)制。