王 洪 付 瑞 魏 杰 賈松華 光嬌娜 馬麗穎 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是支撐生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)展的基礎(chǔ)學(xué)科，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量是保障我國(guó)科研工作質(zhì)量的重要前提。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同科學(xué)儀器和科學(xué)試劑一樣，不僅需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，而且需要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，這是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與非實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要差別。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制包括遺傳質(zhì)量控制，微生物質(zhì)量控制，營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境質(zhì)量控制等很多方面。其中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量關(guān)乎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可信性，甚至決定科研項(xiàng)目的方向和成敗。因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物本身的特殊性，在動(dòng)物的飼養(yǎng)和繁育過(guò)程中，遺傳漂變會(huì)不可避免地發(fā)生，遺傳漂變的不斷累積，將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳背景的改變，進(jìn)而影響科研工作的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如何最大限度地控制遺傳漂變，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性：一方面，應(yīng)采取科學(xué)規(guī)范的飼養(yǎng)繁育方式；另一方面，應(yīng)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)展遺傳質(zhì)量檢測(cè)。

分子標(biāo)記是評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性的工具。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制手段包括生化標(biāo)記檢測(cè)法，微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)法等[1]，其中，微衛(wèi)星方法是國(guó)際通用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制技術(shù)。微衛(wèi)星是廣泛存在于真核生物基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，核心序列為2～6個(gè)bp。不同動(dòng)物個(gè)體的核心序列重復(fù)次數(shù)不同，通過(guò)PCR、電泳和測(cè)序等多種技術(shù)手段識(shí)別不同動(dòng)物微衛(wèi)星片段的差異，從而形成不同品系和不同群體所特有的遺傳背景和遺傳結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳結(jié)構(gòu)信息可以作為該品系遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)，同時(shí)亦可為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供保證。

實(shí)驗(yàn)用貓是眼科疾病斜視弱視動(dòng)物模型，在降壓物質(zhì)檢查試驗(yàn)中不可或缺[2-3]。本研究中的虎皮貓是華北制藥廠于二十世紀(jì)七十年代末開(kāi)始培育的我國(guó)特有的實(shí)驗(yàn)用貓[4]。該群體是我國(guó)歷史最悠久的實(shí)驗(yàn)用貓群體，亦是我國(guó)最早作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中的實(shí)驗(yàn)貓。目前，關(guān)于實(shí)驗(yàn)用貓群體遺傳多樣性的研究資料甚少，隨著我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化體系的不斷完善，實(shí)驗(yàn)用貓的遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)即將發(fā)布。為保證虎皮貓群體的遺傳質(zhì)量，本研究中，利用37個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)該虎皮貓群體的25只動(dòng)物的DNA樣本進(jìn)行遺傳質(zhì)量分析評(píng)價(jià)，旨在為虎皮貓群體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供質(zhì)量保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究使用的虎皮貓血液樣本由華北制藥廠提供，成年虎皮貓的數(shù)量是25只。實(shí)驗(yàn)用貓經(jīng)舒泰麻醉，前肢采集血液入抗凝管，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2儀器和試劑：電泳儀Bio-Rad POWERPAR BASIC，DNA微量分析儀NanoPhotometer，PCR擴(kuò)增儀ABI VeritiTM 96，凝膠成像分析系統(tǒng)GelLogic 212Pro。

DNA marker，Taq 酶，dNTP和10×PCR buffer由Takara提供。ExRed 核酸染料，購(gòu)自莊盟生物。

1.2 方法

1.2.1虎皮貓基因組DNA提?。阂罁?jù)《分子克隆指南》，采用NaI方法提取基因組DNA[5-6]。利用DNA微量分析儀測(cè)定基因組DNA濃度，DNA工作液濃度為50～100 ng/μL，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2微衛(wèi)星位點(diǎn)選擇和引物合成：基于本課題組的前期研究成果，選擇37個(gè)有效擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)，[4]引物合成由上海生工有限公司完成。

1.2.3PCR和電泳[7]：PCR反應(yīng)體系包括：10×buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(A,C,T,G各2.5 mmoL/L)1 μL，上下游引物(100 μmoL/L)各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板(50-100 ng/μL)1 μL，無(wú)菌水13.8 μL。

PCR反應(yīng)程序包括：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火溫度 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。

2.5 瓊脂糖電泳，120 V 30 min，ExRed染色。

1.2.4基因測(cè)序：測(cè)序由擎科基因測(cè)序有限公司完成。測(cè)序結(jié)果經(jīng)GeneMapper 4.0軟件處理，讀取每一份DNA在所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的片段長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用軟件Popgen 1.32，計(jì)算該實(shí)驗(yàn)用貓群體的等位基因數(shù)，雜合度等參數(shù)。應(yīng)用PIC CALC2.0軟件計(jì)算該實(shí)驗(yàn)用貓群體的多態(tài)性信息含量(polymorphism information content, PIC)。

2 結(jié)果

2.1 虎皮貓基因組DNA提取結(jié)果

25只虎皮貓的全血樣本DNA提取結(jié)果詳見(jiàn)表1，圖1和圖2。

表1 25份全血樣本DNA濃度

圖1 1～12號(hào)動(dòng)物基因組DNA瓊脂糖電泳圖

圖2 13～25號(hào)基因組DNA瓊脂糖電泳圖

2.2 微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

虎皮貓群體在74個(gè)備選微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR結(jié)果中有37個(gè)有效擴(kuò)增位點(diǎn)具有良好的多態(tài)性(等位基因數(shù)≥4)，其中FCA1062的PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果詳見(jiàn)圖3和圖4。

圖3 1～12號(hào)虎皮貓?jiān)贔CA1062位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

圖4 13-25號(hào)虎皮貓?jiān)贔CA1062位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果圖

2.3 STR掃描結(jié)果

STR掃描結(jié)果顯示，37個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度可以量化，與瓊脂糖電泳的結(jié)果比較，可以定量分析實(shí)驗(yàn)用貓群體的遺傳結(jié)構(gòu)。FCA1062位點(diǎn)的基因測(cè)序結(jié)果詳見(jiàn)圖5和圖6。

圖5 FCA1062位點(diǎn)雜合基因型STR掃描結(jié)果

圖6 FCA1062位點(diǎn)純合基因型STR掃描結(jié)果

2.4 虎皮貓群體的遺傳結(jié)構(gòu)信息

將基因測(cè)序結(jié)果輸入軟件POPGEN1.32和PIC，統(tǒng)計(jì)分析得到25只虎皮貓群體在37個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)，該虎皮貓群體的平均雜合度為0.6021(0.3416-0.8088)，單因素方差分析觀測(cè)雜合度與期望雜合度，P值>0.05，二者不存在顯著性差異；平均多態(tài)性信息含量是0.552(0.3179-0.7874)；平均香農(nóng)指數(shù)是1.1487(0.6800-1.9223)；平均有效等位基因數(shù)是2.6907(1.5188-5.2301)，單因素方差分析觀測(cè)等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)，P值<0.01，二者存在顯著性差異；37個(gè)位點(diǎn)中，32個(gè)位點(diǎn)的P值>0.05，處于哈代溫伯格平衡(Hardy weinberg equilibrium，HWE)，5個(gè)位點(diǎn)的P值<0.01，偏離哈代溫伯格平衡。具體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表2.

表2 25只虎皮貓?jiān)?7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的遺傳結(jié)構(gòu)參數(shù)

3 討論

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上[7]，應(yīng)用37個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分析華北制藥廠虎皮貓群體的遺傳結(jié)構(gòu)，37個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性(觀測(cè)等位基因數(shù)Na≥4)，多態(tài)性表示群體內(nèi)的遺傳變異[8]，應(yīng)用該37個(gè)多態(tài)性豐富的位點(diǎn)獲取該群體的遺傳結(jié)構(gòu)信息。該群體的平均雜合度為0.6021(0.3416-0.8088)，介于0.5-0.7之間，符合封閉群群體的遺傳結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)，表明該群體已達(dá)到封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)要求。群體的觀測(cè)雜合度與期望雜合度不存在顯著性差異，表明群體繁育方式合理，多樣性豐富，能夠?yàn)閯?dòng)物實(shí)驗(yàn)提供客觀可信數(shù)據(jù)。PIC是檢測(cè)群體多態(tài)性的標(biāo)記值[1]。該群體的平均PIC是0.552(0.3179-0.7874)，PIC>0.5，表明該群體屬于高度多態(tài)性群體。與人類群體的遺傳結(jié)構(gòu)特征相似，作為人類疾病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，能夠較為客觀地提供可比性數(shù)據(jù)。該群體的香農(nóng)指數(shù)為1.1487(0.6800-1.9223)。香農(nóng)指數(shù)反映了物種的豐富度和相對(duì)密度[9]。香農(nóng)指數(shù)越大，表明等位基因分布越均勻。香農(nóng)指數(shù)主要用來(lái)衡量遺傳多樣性以及遺傳多樣性的分布情況。有效等位基因數(shù)是反映生物群體遺傳變異程度的一個(gè)指標(biāo),有效等位基因數(shù)與觀測(cè)等位基因數(shù)越接近,說(shuō)明等位基因在群體中的分布越均勻。通過(guò)微衛(wèi)星技術(shù)檢測(cè)等位基因數(shù)在不同染色體上的分布,從而獲得等位基因的分布情況。該群體的平均有效等位基因數(shù)是2.6907(1.5188-5.2301)，觀測(cè)等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)存在顯著性差異，表明該群體等位基因分布不均勻。群體遺傳學(xué)中，HWE是最重要的指標(biāo)。HWE是指等位基因頻率與基因型頻率一致。偏離HWE的起因主要是選擇和非隨機(jī)交配。該群體在32個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)符合HWE，在5個(gè)位點(diǎn)偏離HWE。偏離HWE,表明出現(xiàn)近親繁殖，種群分層，基因分型問(wèn)題等[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育機(jī)構(gòu)應(yīng)采取必要措施保障群體遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞的品種品系鑒定，尤其是在實(shí)驗(yàn)小鼠，大鼠，地鼠和小型豬的遺傳質(zhì)量控制方面有較為廣泛和深入的應(yīng)用[11]。2017年中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)組織起草并發(fā)布實(shí)施了團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)方法[12]，標(biāo)志著我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制手段已逐步實(shí)現(xiàn)與國(guó)際水平接軌。實(shí)驗(yàn)用貓的遺傳質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)即將發(fā)布實(shí)施，近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求個(gè)體之間具有基因一致性，封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物要求群體內(nèi)個(gè)體的遺傳多樣性豐富，而作為群體整體的遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定?；⑵へ埲后w的遺傳多樣性分析的相關(guān)資料甚少，衣帥等[13]在2013年應(yīng)用24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)實(shí)驗(yàn)用虎皮貓群體的34只動(dòng)物進(jìn)行過(guò)遺傳結(jié)構(gòu)分析，本研究保留與2013年研究的相同微衛(wèi)星位點(diǎn)，比較同一群體，同一組微衛(wèi)星位點(diǎn)2012年和2017年獲取的遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的差異，進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示該虎皮貓群體的關(guān)鍵遺傳多樣性參數(shù)雜合度，香農(nóng)指數(shù)，等位基因數(shù)均無(wú)顯著性差異。表明該虎皮貓群體經(jīng)過(guò)5年的繁育，遺傳結(jié)構(gòu)依然穩(wěn)定。遺傳漂變是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)繁育過(guò)程中必然發(fā)生的過(guò)程，因此，定期開(kāi)展遺傳質(zhì)量檢測(cè)工作意義重大。遺傳質(zhì)量檢測(cè)能夠最小化遺傳漂變對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的影響，同時(shí)最大化動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性[14-15]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)是一種有效的封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析手段，本研究成果為我國(guó)實(shí)驗(yàn)用貓群體的遺傳質(zhì)量控制提供檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)了我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)水平與國(guó)際水平接軌的目的，同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)用貓群體的開(kāi)發(fā)利用提供保證。