張 琦，何國(guó)慶

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310085)

食物過(guò)敏是一個(gè)備受各國(guó)政府及公眾關(guān)注的健康問(wèn)題，而牛乳是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定的八大類主要過(guò)敏食物之一［1］。牛乳蛋白過(guò)敏(cow’s milk protein allergy，CMPA)可引發(fā)過(guò)敏性鼻炎、哮喘、濕疹、腹瀉、胃腸出血等癥狀［2］。這種過(guò)敏反應(yīng)會(huì)威脅嬰幼兒健康，甚至導(dǎo)致其死亡。據(jù)調(diào)查顯示，對(duì)牛乳過(guò)敏的學(xué)齡前兒童占0.6%～2.5%，5～16歲人群占0.3%，成年人小于0.5%［3］。

目前，降低牛奶致敏性的方法主要可以分為物理法、化學(xué)法、生物酶法等。物理法主要通過(guò)去折疊、聚合、交聯(lián)等方式來(lái)改變蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，但并不改變其一級(jí)結(jié)構(gòu)［4］，可以在使蛋白質(zhì)改性的同時(shí)又能維持乳蛋白原有的感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。生物酶法是目前應(yīng)用較為廣泛的一種水解方式，其操作較為簡(jiǎn)單，安全性高，并且可以與物理方法相結(jié)合來(lái)增強(qiáng)水解效果［5］。

針對(duì)牛乳蛋白改性，酶解法一直是研究的重點(diǎn)。利用蛋白酶的內(nèi)切和外切作用，使蛋白質(zhì)降解為肽類產(chǎn)物和較小氨基酸分子，酶解技術(shù)按照酶解程度和酶解后產(chǎn)物分子量大小及分布情況可分為輕度酶解(Slight hydrolysis)、適度酶解(Moderate hydrolysis)和深度酶解(Extensive hydrolysis)。其中，輕度酶解和適度酶解通常被劃歸為限制性酶解，因其可實(shí)現(xiàn)水解度和產(chǎn)物多樣性控制而多應(yīng)用于生產(chǎn)功能性蛋白和活性肽。深度酶解則多用于得到低抗原性酶解產(chǎn)物，因其產(chǎn)物主要是短肽和單體氨基酸，并且90%的肽分子量都低于500 Da，經(jīng)常應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)配方。同時(shí)，酶解分為單酶水解和復(fù)合酶水解，采用復(fù)合酶水解時(shí)根據(jù)不同酶的添加順序又可以分為同步酶解和分步酶解［6］。

目前，雖然酶解技術(shù)逐漸完善，但體系方法相對(duì)單一，如果想將酶水解工業(yè)化應(yīng)用，那么水解位點(diǎn)的準(zhǔn)確控制、水解產(chǎn)物組成及分子量分布以及對(duì)于水解產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用等，都是亟待解決的問(wèn)題。如果可以將其與當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的抗原表位信息和酶的作用位點(diǎn)信息相結(jié)合，以進(jìn)行針對(duì)性地破壞，得到理想的目標(biāo)產(chǎn)物，對(duì)于低敏乳品的開(kāi)發(fā)將具有重大意義。

本文主要對(duì)牛乳過(guò)敏蛋白致敏表位、幾種生物酶水解技術(shù)及其作用效果和引起抗原性降低的可能機(jī)制進(jìn)行綜述，希望可以為低致敏乳制品研究和定向水解提供依據(jù)。

1 牛乳主要過(guò)敏原及其抗原表位

在牛乳中含有的30多種蛋白質(zhì)中，主要的過(guò)敏原是酪蛋白(CN)、β－乳球蛋白(β－LG)及α－乳白蛋白(α－LA)，牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(IDS)及乳鐵蛋白(LF)被認(rèn)為是次要過(guò)敏原［7］。

1.1 酪蛋白

酪蛋白占乳蛋白總量的78%～80%，包括四種類型:αs1－(40%)、αs2－(10%)、β－(35%)和κ－(12.5%)，四種酪蛋白通常聚合成懸浮在乳清中的微粒，它們都是磷酸化的蛋白質(zhì)，其三級(jí)結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化［1］。αs1－酪蛋白是由199個(gè)氨基酸殘基組成的線性單鏈磷酸化蛋白，分子量為23 k Da，是酪蛋白中最主要的過(guò)敏原。每個(gè)分子中結(jié)合有8個(gè)磷酸根，大部分分布在45～89位，不含二硫鍵。其中，αs2－酪蛋白親水性最強(qiáng)、分子量最大，在25 kDa左右。β－酪蛋白的性質(zhì)最為穩(wěn)定，疏水性和抗原特異性最強(qiáng)［8］。κ－酪蛋白結(jié)構(gòu)性最高，對(duì)鈣離子不敏感，是唯一含糖的酪蛋白。

線性表位(特定的氨基酸序列肽段)研究表明酪蛋白約包含60個(gè)IgE結(jié)合位點(diǎn)，αs1－、αs2－、β－和κ－酪蛋白分別占據(jù)20、17、13和10個(gè)［9］。對(duì)αs1－酪蛋白的研究中，已經(jīng)得到了與T細(xì)胞結(jié)合的表位aa43～66，aa73～96，aa91～114，aa127～180［10］;IgG結(jié)合表位aa21～35，aa56～70，aa161～175，IgE結(jié)合表位aa6～20，aa11～25，aa126～140，aa171～185［11］;對(duì)αs1－酪蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)αs1－酪蛋白的1～16位是信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，有3個(gè)糖基化位點(diǎn)、5個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，通過(guò)IEDB數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了αs1－酪蛋白的抗原區(qū)為aa16～29，aa45～50，aa52～54，aa56～70，aa74～75，aa77～86，aa94～104，aa142～152，aa173～179，aa185～210［12］。在αs2－酪蛋白表位研究中，發(fā)現(xiàn)了主要IgE結(jié)合表位aa83～100，aa143～158，aa157～172，aa165～188。另外，aa31～44，aa43～56，aa93～106，aa105～114，aa117～128，aa191～200是它的六個(gè)次要過(guò)敏表位［13］。

IgE結(jié)合表位aa1～16，aa83～92，aa135～144和IgG結(jié)合表位aa1～14，aa23～34，aa55～68，aa79～92，aa107～120，aa135～144，aa149～160，aa183～208，主要可以被B細(xì)胞結(jié)合，其中aa83～92和aa135～144是二者共有的表位［14］。在構(gòu)象性表位的研究中，劉法輝［15］定位出β－酪蛋白的4個(gè)構(gòu)象性表位;κ－酪蛋白的3個(gè)主要IgE表位:aa9～26，aa21～44，aa47～68可以被93%的患者血清結(jié)合，2個(gè)主要IgG表位為aa55～80和aa105～116。

1.2 β－乳球蛋白

β－乳球蛋白占牛奶乳清蛋白總量的50%以上，是公認(rèn)的牛奶中最主要的過(guò)敏原之一，它含有162個(gè)氨基酸殘基，分子量為18.3 kDa左右，等電點(diǎn)為5.3，有2個(gè)遺傳變異體，由4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵和1個(gè)鏈間二硫鍵連接組成，呈水溶性［16］。其能抵抗胃酸和胃蛋白酶的作用，進(jìn)入血液循環(huán)從而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)［15］。有文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，牛乳過(guò)敏人群中的82%是對(duì)β－乳球蛋白過(guò)敏［17］。

牛乳β－乳球蛋白中最主要的致敏表位為aa41～60，aa102～124，aa149～162，90%以上的牛乳過(guò)敏患者的T細(xì)胞都可以識(shí)別這三個(gè)表位［18］。目前隨著對(duì)β－乳球蛋白的關(guān)注越來(lái)越深入，對(duì)其過(guò)敏表位的探究也日漸增多。通過(guò)酶法切割抗原定位出了IgE結(jié)合表位，最主要的有肽段aa102～124，aa41～60，aa149～162;主要過(guò)敏原表位有aa1～8，aa25～40;次要過(guò)敏原表位aa9～14，aa84～91，aa92～100［19］。利用病人血清通過(guò)肽掃描技術(shù)，定位出了牛乳β－乳球蛋白的IgE結(jié)合表位aa1～16，aa31～48，aa47～60，aa67～78，aa75～86，aa127～144，aa141～152，aa17～31，aa72～86，aa92～106，aa152～166和IgG結(jié)合表位aa1～16，aa51～64，aa67～78，aa85～96，aa129～144，aa139～156，aa22～36，aa127～141［20－21］。后期又通過(guò)肽掃描定位的方法找到了兩個(gè)新的表位aa134～143，aa150～159［22］。在構(gòu)象性表位(肽鏈折疊后一些特定氨基酸基團(tuán)構(gòu)成的特定空間構(gòu)型)的研究中，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)牛乳β－乳球蛋白表位L87～N88～N90～K91～E108～S110，I2～T4～P113～Q115～P144，T18～Y20～E44～E45～K47～E55～E157［23］。

1.3 α－乳白蛋白

α－乳白蛋白由123個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子量為14.2 k Da，蛋白結(jié)構(gòu)中有四個(gè)二硫鍵，并且對(duì)鈣具有高親和性。這保證了其二級(jí)結(jié)構(gòu)和天然構(gòu)象的穩(wěn)定性［4］。α－乳白蛋白占乳清蛋白的25%，與人乳中的α－乳白蛋白同源性為74%，另有6%的氨基酸殘基化學(xué)性質(zhì)相似［24］。在線性表位方面，4個(gè)IgE表位aa1～16，aa13～26，aa47～58，aa93～102和3個(gè)IgG結(jié)合表位aa7～18，aa51～61，aa89～108，其中aa7～18，aa51～58為共識(shí)結(jié)合表位［21］。在對(duì)于α－乳白蛋白T細(xì)胞表位的研究中，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)表位:aa19～36，aa25～42，aa31～48，aa43～60［25］。Adams等［26］在合成肽aa5－18中發(fā)現(xiàn)了α－乳白蛋白的IgE線性結(jié)合表位。叢艷君等［27］通過(guò)固相合成技術(shù)，合成α－乳白蛋白系列多肽并以牛乳過(guò)敏患者血清為探針，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附分析法識(shí)別到α－乳白蛋白的5個(gè)IgE作用表位aa1～15，aa6～20，aa46～60，aa71～85，aa101～115;其中V8，F(xiàn)9，R10，Y103，L105，H107為影響α－乳白蛋白致敏性的關(guān)鍵氨基酸;并以相同方法定位α－乳白蛋白的IgG作用表位的氨基酸序列為aa6～20，aa21～35、aa36～50和aa86～100;關(guān)鍵氨基酸為F9、L15、P24、W26和H32。

2 生物酶解法水解牛乳蛋白技術(shù)

蛋白酶可以水解蛋白質(zhì)肽鏈，破壞過(guò)敏蛋白的結(jié)構(gòu)，從而顯著降低蛋白質(zhì)的過(guò)敏性。對(duì)于牛乳蛋白來(lái)說(shuō)，蛋白酶可以將其水解為小分子乳蛋白、乳蛋白肽甚至是氨基酸，能夠降低它的致敏性［28］。目前比較成熟的商品化酶主要有包括木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶在內(nèi)的多種蛋白酶。不同的酶對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)不同，如中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶沒(méi)有特異性作用位點(diǎn)，胰蛋白酶主要水解Lys－或Arg－殘基，胃蛋白酶水解芳香族氨基酸的N端或者C端，堿性蛋白酶作用于疏水性氨基酸的C端，木瓜蛋白酶內(nèi)切Arg－、Lys－和Phe－殘基等［29］。

早期對(duì)于酶解法的研究主要集中在用一種蛋白酶單獨(dú)進(jìn)行水解，后來(lái)發(fā)展為用兩種以上的酶進(jìn)行復(fù)合水解，起到彼此補(bǔ)充的作用。目前工業(yè)上生產(chǎn)配方乳粉大多采用成熟的熱加工輔助酶解法。但是，在應(yīng)用過(guò)程中，熱加工輔助酶解法會(huì)影響乳產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)和感官品質(zhì)。因此，用其他物理處理方法輔助酶解近年來(lái)也備受關(guān)注。

2.1 單酶水解牛乳蛋白

直接單酶法的研究重點(diǎn)是根據(jù)不同過(guò)敏原蛋白的性質(zhì)而選擇相應(yīng)的蛋白酶。研究結(jié)果表明直接單酶法具有較為顯著的效果。

αs1－酪蛋白分別被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解，其中胰蛋白酶水解后，蛋白質(zhì)的抗原性降低了85%，而胰凝乳蛋白酶在pH7.8時(shí)降低了63%。p H2.2時(shí)抗原性降低60%［30］。選用7種不同的生物酶水解酪蛋白［31］，中性蛋白酶水解效果最好，并且水解產(chǎn)物的抗原性顯著降低。用5種酶水解酪蛋白的結(jié)果表明，堿性蛋白酶在降低酪蛋白抗原性方面效果最好，因?yàn)閴A性氨基酸的裂解位點(diǎn)包含疏水氨基酸的羧基末端而酪蛋白中的疏水氨基酸含量比較高，因此酪蛋白可以水解得更加完全以獲得所需的效果;但是木瓜蛋白酶不僅可以降低酪蛋白的抗原性，而且可以獲得更好的酶解產(chǎn)物風(fēng)味，從而得出木瓜蛋白酶更適合水解酪蛋白的結(jié)論［32］。汝成業(yè)等［33］篩選得到一株優(yōu)先降解αs1－酪蛋白的產(chǎn)堿性蛋白酶菌株，但其游離酶穩(wěn)定性較差，故采用海藻酸鈉包埋法對(duì)純化獲得的堿性蛋白酶進(jìn)行固定化，對(duì)αs1－酪蛋白作用的特異性較強(qiáng)，不影響乳制品的使用，同時(shí)可以提高回收率，實(shí)現(xiàn)多次使用。在乳清蛋白方面，有研究表明［34］，用胃蛋白酶和胰蛋白酶分別酶解100℃加熱處理后的乳清蛋白，酶解產(chǎn)物的抗原性均顯著降低。這是由于乳清蛋白包含相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。在酶解對(duì)乳清蛋白的抗原性影響研究中［35］，用7種生物酶分別水解乳清蛋白，堿性蛋白酶的效果最佳，主要原因是堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)中包含疏水性氨基酸的羧基，可以較大程度地使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵斷裂，從而達(dá)到破壞抗原表位的目的。

2.2 多酶復(fù)合水解牛乳蛋白

選用微生物內(nèi)肽酶加外肽酶酶解乳清，水解產(chǎn)物經(jīng)分子和細(xì)胞檢測(cè)，酶解產(chǎn)物對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的抑制作用較為明顯，而對(duì)T細(xì)胞的刺激響應(yīng)較慢［36］。Wroblewask等［37］分別嘗試了單獨(dú)使用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶，以及二者混合使用，分別在水解開(kāi)始時(shí)和水解1.5 h后再加入，水解相同時(shí)間，最終結(jié)果表明兩種酶兩步水解的效果最佳。在先用胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶單獨(dú)水解，再用兩種酶進(jìn)行分步水解牛乳蛋白的實(shí)驗(yàn)中，三種方法均降低了α－乳白蛋白、β－乳球蛋白、酪蛋白，并且其中兩種酶分步水解法對(duì)抗原性的降低程度最顯著，得到的水解產(chǎn)物中小分子量(小于5 kDa)的肽段含量更高，產(chǎn)物中的苦味肽含量也最少［38］。有實(shí)驗(yàn)以牛乳β－酪蛋白為原料對(duì)其進(jìn)行體外模擬消化，探討胃腸消化條件下，胃蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合酶連續(xù)消化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能特性，結(jié)果表明，復(fù)合酶消化產(chǎn)物水解度最大［39］。與單酶水解相比較，復(fù)合酶水解效果更好［40］，是因?yàn)椴煌傅拿盖形稽c(diǎn)可以互相補(bǔ)充，作用更多的致敏表位，實(shí)現(xiàn)多次切割，使蛋白質(zhì)水解得更加完全，斷裂成更小的肽段其包含完整抗原的可能性也更小［41］。

2.3 物理法－酶解法偶聯(lián)技術(shù)

在酶解前或者酶解過(guò)程中與其他的物理方法偶聯(lián)，是現(xiàn)在研究較多的一個(gè)方向。Ambrosi等［42］在不同的壓力條件下用α－胰凝乳的蛋白酶和菠蘿蛋白酶水解乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)水解程度在一定范圍內(nèi)隨著壓力和時(shí)間的增加而增大，并且暴露出更多的抗原表位。壓力的影響主要與蛋白質(zhì)的去折疊有關(guān)，使其在天然結(jié)構(gòu)中不易被接觸到的酶作用區(qū)域暴露。高壓導(dǎo)致完整的蛋白快速分解，使中等大小的肽段積累，然后再進(jìn)一步被水解為更小的片段［43］。用BALB/c小鼠作為模型用于評(píng)估高壓處理下用胃蛋白酶酶解得到的乳清蛋白水解產(chǎn)物的誘導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)的能力，部分證實(shí)了高壓水解產(chǎn)物的低致敏性［44－45］，另外，隨著高壓的壓強(qiáng)、加壓時(shí)間以及溫度的變化，水解產(chǎn)物的抗原性也會(huì)受到影響，出現(xiàn)先上升后下降的情況［46］。通過(guò)微波輔助胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和混合酶分別水解乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)微波輔助對(duì)降低乳清蛋白的抗原性具有顯著作用［47］。在探究超聲波預(yù)處理對(duì)菠蘿蛋白酶水解乳清蛋白的影響的實(shí)驗(yàn)中，超聲處理提高了蛋白質(zhì)對(duì)菠蘿蛋白酶的敏感性，顯著提高了水解速率以及生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化速率，并且通過(guò)差示掃描量熱法(DSC)觀察到了超聲處理引起蛋白質(zhì)的變性和聚集［48］。超聲同樣可以使酪蛋白在低分子量區(qū)域的組分比例明顯增加［49］，通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)特征而使抗原性降低。

通過(guò)單酶水解、復(fù)合酶水解和物理法輔助酶解技術(shù)得到的水解產(chǎn)物其抗原性顯著降低，說(shuō)明這些方法效果優(yōu)良，并且不同方法的有機(jī)結(jié)合有效減少了對(duì)產(chǎn)物原有品質(zhì)的影響。但是在實(shí)際應(yīng)用中，具體酶的選用和處理方式對(duì)于產(chǎn)物的風(fēng)味的影響還需進(jìn)一步考慮。

3 生物酶法水解過(guò)敏原的機(jī)制

能夠致敏的蛋白一般對(duì)胃腸道的消化功能有著較強(qiáng)的抵抗力，因此在體外預(yù)先對(duì)蛋白進(jìn)行酶解是消除部分免疫原性的有效方法之一。酶的種類和水解能力直接影響蛋白質(zhì)構(gòu)象表位的破壞和線性表位的斷裂，是完整的抗原表位能否存在的決定性因素［50］。比較常用的蛋白酶有植物源的菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶;動(dòng)物源的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶;微生物源的堿性蛋白酶、中性蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶等。

用蛋白酶對(duì)乳蛋白進(jìn)行限制性切割使致敏蛋白的肽鍵斷裂成小分子肽段，能夠達(dá)到降低其分子量的目的(破壞線性表位)，或者通過(guò)影響蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，去除蛋白質(zhì)表面和空間中的的一些構(gòu)象抗原表位，使其無(wú)法被識(shí)別，來(lái)降低抗原性［51］。在利用乳酸菌產(chǎn)酶水解乳清蛋白的研究中，隨著蛋白酶的不斷產(chǎn)生與積累，主要致敏蛋白的抗原性先降低，再上升，再降低，這是由于在經(jīng)蛋白酶初步水解形成大肽后，一些隱形表位或線性表位被暴露出來(lái)，而隨著時(shí)間延長(zhǎng)，這些表位又逐漸被降解，從而造成了最終抗原性的降低［52］。在用胃蛋白酶、胰蛋白酶及復(fù)合酶水解牛乳蛋白的研究中，紅外光譜和SDS電泳結(jié)果表明，酶解后，蛋白分子量由24 kDa降低到17、10 k Da等小分子量肽，二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，α－螺旋含量下降，β－折疊含量下降，表面疏水性降低［35］。有研究利用一種絲氨酸蛋白酶對(duì)牛乳蛋白進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白與酪蛋白隨著水解度的增加，疏水性降低，同時(shí)抗原性也隨之降低［53－54］。

目前，利用生物酶水解蛋白的工藝都具有一定的隨機(jī)性，造成了水解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性。將過(guò)敏原蛋白的線性表位和構(gòu)象性表位信息合理地與不同生物酶的特異性酶切位點(diǎn)進(jìn)行搭配，針對(duì)性地破壞抗原表位，定向得到理想的低抗原性酶解產(chǎn)物，可以作為獲得低致敏性乳蛋白的重要途徑。

4 展望

目前，通過(guò)研究確定的牛乳蛋白中的抗原表位越來(lái)越豐富，抗原酶解技術(shù)日趨完善，配方奶粉的種類也越來(lái)越多。然而只利用蛋白酶進(jìn)行水解，得到的水解產(chǎn)物具有很強(qiáng)的隨機(jī)性，不能保證產(chǎn)物的組成。在未來(lái)的研究中，將已有的過(guò)敏原表位信息和生物酶的酶切位點(diǎn)特異性相結(jié)合，可能是比較高效的、得到低抗原性水解產(chǎn)物的方法。若再偶聯(lián)合適的物理方法，則對(duì)致敏蛋白的水解效果可能更為有效，在此基礎(chǔ)上，也可以嘗試將化學(xué)等方法與酶解過(guò)程相結(jié)合，如此可以進(jìn)一步完善脫敏技術(shù)，提高生產(chǎn)效率，為未來(lái)的低敏性奶粉的生產(chǎn)提供新的方向。