車琳，趙文理

[1蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州；2上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院（原蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院），上海]

0 引言

急性淋巴細(xì)胞性白血?。╝cute lymphocytic leukemia,ALL）為兒童中發(fā)生率較高的惡性腫瘤。在初診過(guò)程中進(jìn)行染色體或基因異常的檢測(cè)有助于更好地指導(dǎo)臨床治療，促進(jìn)預(yù)后。當(dāng)前熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）與染色體核型技術(shù)在這一檢測(cè)中得到了應(yīng)用。本研究就這一技術(shù)在ALL診斷中的應(yīng)用進(jìn)行了分析。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇研究區(qū)間為2011年11月至2013年12月，入選研究樣本為132例本院初步診斷為ALL的患兒，對(duì)患兒均實(shí)施了血常規(guī)五分類、骨髓穿刺涂片或活檢、細(xì)胞遺傳學(xué)等檢測(cè)方法，患兒病情均符合血液學(xué)關(guān)于ALL的診斷標(biāo)準(zhǔn)，被確診[1]。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光原位雜交

1.2.1.1 儀器

水浴箱，熒光顯微鏡，雜交儀，震蕩儀，離心機(jī)。

1.2.1.2 試劑

乙醇（濃度為70%、85%、100%），2*SSC、0.4*SSC（saline sodium citrate），DAPI（4-6-diamidino-2phenylindole）II溶液。

1.2.1.3 探針

包括4、10、17號(hào)染色體、CBFβ、AML1/ETO、PML/RARα、BCR/ABL、5q-、11q23等。

1.2.1.4 操作程序

（1）玻片準(zhǔn)備：在玻片上滴上獲取的標(biāo)本，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行滴片質(zhì)量的觀察，對(duì)雜交區(qū)域做好標(biāo)記，標(biāo)本質(zhì)量理想狀態(tài)為細(xì)胞均勻分布，密度適宜，無(wú)重疊現(xiàn)象，胞漿含量少。然后將以上玻片置于37℃水浴預(yù)溫的2*SSC溶液中，進(jìn)行30min的老化處理，之后使用各個(gè)不同濃度的乙醇于室溫條件下進(jìn)行階梯脫水處理，時(shí)間為2-3 min，室溫下晾干；（2）探針準(zhǔn)備：5μl緩沖液及1μl探針加入0.5ml離心管中混勻，離心1-3s；（3）雜交：①在玻片劃定的雜交區(qū)域加10μl探針混合液，使用蓋玻片（規(guī)格為18×18mm）將其蓋好后使用封片膠進(jìn)行封片，置入雜交儀，②雜交儀設(shè)置：72℃-75℃的變性溫度，2-5 min，37℃的雜交溫度，16-18h；（4）洗滌（快洗）：72℃的0.4*SCC缸內(nèi)溫度，2 min，2*SSC室溫2 min，100%乙醇2 min；（5）復(fù)染：各雜交區(qū)域均加10μl DAPI II溶液，蓋玻片封片后室溫雜染15 min；（6）鏡檢：每張片隨機(jī)分析計(jì)數(shù)200-1000個(gè)間期核，進(jìn)行相應(yīng)雜交信號(hào)的記錄。陽(yáng)性界定值下限設(shè)為0.5%-5%。

1.2.2 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

對(duì)骨髓采取直接法或是24h培養(yǎng)法進(jìn)行染色體的制備，R顯帶或G顯帶技術(shù)分析核型，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN1995）》描述染色體異常[2]。

1.2.2.1 短期培養(yǎng)法

（1）骨髓液6-8ml注入含1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在超凈臺(tái)上從培養(yǎng)瓶抽取少許骨髓標(biāo)本并滴于載玻片上，用Hb吸管吸20μl于0.38ml 2%白細(xì)胞稀釋液（2%HAC）中，將其充分混勻，鏡下進(jìn)行有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行24h的培養(yǎng)；（2）加80μl秋水酰胺后繼續(xù)置入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1h；（3）放入到10ml離心管中，轉(zhuǎn)速為每分鐘1000r，離心10min，與此同時(shí)將低滲液在37℃條件下進(jìn)行預(yù)熱）；（4）將上清液去除，將低滲液加入其中配置成8ml，充分進(jìn)行混勻，放入37℃水浴箱，時(shí)間為35 min；（5）將其從水浴箱取出，加固定液1-2ml，將其配制為9-10ml，打勻后馬上進(jìn)行離心處理，每分鐘1000r的轉(zhuǎn)速下離心10 min；（6）將上清液去除，加入固定液配成10ml，混勻后放在室溫下30min，然后以1000r/min離心10min，此步驟再重復(fù)進(jìn)行2遍；（7）去除上清液，加1-2ml固定液，混勻加蓋在4℃下保存。

1.2.2.2 直接法

（1）骨髓液6-8ml注入含1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，在清潔瓶中注入標(biāo)本，使用生理鹽水加至瓶子2/3的位置，然后加300μl秋水酰胺，37℃下進(jìn)行1h培養(yǎng)或4℃環(huán)境下進(jìn)行3-4h培養(yǎng)；（2）轉(zhuǎn)到2個(gè)離心管中，1000r/min進(jìn)行10min處理，期間低滲液在37℃條件下進(jìn)行預(yù)熱；（3）棄上清，加8ml低滲液，放入37℃水浴箱處理40min；之后按照24h培養(yǎng)法進(jìn)行處理。

1.2.2.3 R顯帶

適用于骨髓標(biāo)本：（1）打勻骨髓細(xì)胞懸液，制作4-6張滴片，在潔凈濾紙上平鋪開，待干；（2）取白瓷立式染缸（容積50ml）2-3只，倒入pH6.5的Earle’s溶液，加蓋后放進(jìn)水浴箱將其加熱到87.5℃；（3）玻片標(biāo)本表面干燥后，置于預(yù)溫87.5℃的Earle’s溶液中溫育（時(shí)間1-2h），注意玻片之間留一點(diǎn)間隔；（4）溫育1h，之后間隔5-10min將其中的1-2片拿出來(lái)，流水沖洗；（5）用10%Giemsa染色液處理8-10min，然后水洗，待干，鏡檢。觀察最初取出的標(biāo)本上染色體顯帶，以此幫助判斷顯帶合適需要的時(shí)間。

1.2.2.4 G顯帶

適用于外周血標(biāo)本：（1）標(biāo)本老化或烤片：將滴有標(biāo)本的滴片放在37℃溫箱中放置7d，也可以放在80℃烤箱中進(jìn)行2-4h的烘烤，讓其自行冷卻；（2）將生理鹽水配置的0.1%胰酶溶液和0.02%乙二胺四乙酸鈉按1:1比例混合，然后用10%NaHCO3或3%Tris溶液調(diào)為6.8-7.0的pH值，37℃水?。唬?）玻片置于以上溶液，輕輕振蕩30-60s或更長(zhǎng)時(shí)間；（4）胰酶處理完畢后馬上取出片子，在PBS溶液中進(jìn)行2次一過(guò)性漂洗；（5）用5%Giemsa染色液處理5-10min；（6）自來(lái)水沖洗，待干，鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

組間（%）的比較實(shí)施卡方檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05代表有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

ALL患兒共132例，男67例，女65例，男女性別比為1.03∶1，最小1歲，最大16歲，平均5歲，B-ALL、T-ALL分別有126例、4例，另有1例B+髓系混合細(xì)胞白血病，1例免疫分型不明確。

患兒遺傳結(jié)果見表1，顯帶方法檢出異常核型45例（34.1%），其中共10種單純數(shù)量異常，共計(jì)20例（超二倍體12例，亞三倍體4例，超單倍體1例，四倍體1例，1例47，XY，+X[9]/46，XY[4]，1例全片僅3個(gè)分裂相，有單純結(jié)構(gòu)異常13種（15例），其中t（1；19）3例，add(X)(q27)Y,del(7)(p13),i(21)(q10)1例，t（9；22）5例，t（9；11）、t（4；11）、t（12；17）、t（2；13）各1例，1q+，6q-（q23）1例，del（2）（p12），t（9；22）（q34；q11）1例，同時(shí)有2種異常的共10例，其中t（9；11）（p22；q23），+20，+22[5]1例，4p-，-12,12p+,21q+ 1例，超二倍體4例，其中合并1q+、12p+的分別有3例、1例，另有4例亞三倍體。FISH結(jié)果中，陰性47例，異常85例（64.4%），其中結(jié)構(gòu)異常共34例，23例TEL/AML1，BCR/ABL、MLL重排各有6例，數(shù)量異常57例，數(shù)量、結(jié)構(gòu)混合異常的共有6例，兩種方法下有65例結(jié)果一致，其中正常核型、亞三倍體、超二倍體、超單倍體、BCR/ABL、MLL重排分別有31例、8例、16例、1例、6例、3例。對(duì)表2結(jié)果實(shí)施χ2檢驗(yàn)，結(jié)果為χ2=24.2，P＜0.05，提示FISH在ALL患兒遺傳異常的檢測(cè)中比顯帶技術(shù)更優(yōu)。

表1 ALL患兒兩種方法主要異常檢出結(jié)果（n）

表2 顯帶及FISH在ALL患兒遺傳異常檢測(cè)中的應(yīng)用（n）

表3示，F(xiàn)ISH檢出正常核型中有28例異常，數(shù)目異常、TEL/AML1、MLL重排分別為14例、13例、1例。未見分裂相的28例中，F(xiàn)ISH檢出7例陰性，有21例檢出異常，其中數(shù)量異常10例，TEL/AML1有9例，MLL重排共2例。傳統(tǒng)檢測(cè)方法異常、FISH正常的患者共有9例，χ2檢驗(yàn)后得χ2=5.86，P＜0.05，研究提示，染色體顯帶失敗可以使用FISH方法，有利于提升異常檢出率。

表3 FISH在染色體分析失敗及核型正?；純褐械膽?yīng)用（n）

3 討論

ALL為發(fā)生率較高的兒童惡性腫瘤疾病，初診若能檢出染色體或基因異常，會(huì)更好地指導(dǎo)治療，促進(jìn)預(yù)后。傳統(tǒng)檢查方法對(duì)ALL遺傳異常的檢出率有待提升，約25%無(wú)法檢出，無(wú)論是成人還是兒童ALL預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素判斷中，F(xiàn)ISH均扮演重要角色[3]，因此有必要進(jìn)行不同方法的聯(lián)合檢測(cè)。

由于FISH檢驗(yàn)不受細(xì)胞分裂周期影響，有較高的分辨率，因此對(duì)ALL各種異常均有較高的靈敏度，比顯帶技術(shù)的檢測(cè)效果更優(yōu)，能夠更好地檢出顯帶技術(shù)未檢出的異常[4]。此外，F(xiàn)ISH對(duì)于染色體內(nèi)部改變的鑒別敏感性不如細(xì)胞遺傳學(xué)方法，并受到探針種類的限制。

3.1 超二倍體、亞三倍體及亞二倍體

本研究中，顯帶技術(shù)檢出8例亞三倍體，超二倍體16例，占ALL患兒的12.1%，亞二倍體沒有檢出。以上檢出的亞三倍體、超二倍體都是B-ALL，其中有3例（18.8%）超二倍體存在結(jié)構(gòu)異常，均為1q+，經(jīng)FISH檢測(cè)，24例患兒均為陽(yáng)性。受到條件限制，我們只能對(duì)部分染色體數(shù)目異常進(jìn)行檢測(cè)（包括4號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、12號(hào)、17號(hào)、21號(hào)、22號(hào)及性染色），有17例增加3條以上染色體，但是不能確定類型。

3.2 TEL/AML1

即ETV6/RUNX1，具有遺傳學(xué)隱秘性，即對(duì)常規(guī)染色體顯帶隱秘，在兒童ALL中約25%的ETV6 (TEL) 和RUNX1 (AML1)隱匿異位未被發(fā)現(xiàn)直到FISH技術(shù)出現(xiàn)[5]。通過(guò)FISH技術(shù)，本研究檢出17.4%（23/132）TEL/AML1基因，均為B-ALL，比北京兒童醫(yī)院、SJCRH-15研究，荷蘭Emma醫(yī)院等的研究結(jié)果略低，比DCOG-9研究結(jié)果略高[6-8]，檢出+21*2的有1例，其余沒有檢出21號(hào)染色體內(nèi)部擴(kuò)增等其他異常。全部患兒中，22例＜10歲，15例3-5歲，平均5歲，與相關(guān)研究一致。

3.3 MLL重排

MLL基因位于11q23，多數(shù)11q23異常可通過(guò)核型顯帶法檢出，但對(duì)于一些隱匿異位、尚未確認(rèn)的重排形式、較稀少的異位染色體無(wú)法檢測(cè)，如t（11；19）、t（6；11），通過(guò)FISH可以作為補(bǔ)充檢測(cè)手段，提升檢出率[1,9]。本研究通過(guò)顯帶技術(shù)檢出3例MLL重排，檢出率2.3%，2例t（9；11），1例t（4；11）。FISH檢出4.5%（6/132）不能確定類型的MLL重排，和北京兒童醫(yī)院（2.4%）、英國(guó)兒童（2%）、荷蘭Emma醫(yī)院（6.8%）略有差異[6,8]。還檢出1例核型正常B-ALL，顯帶無(wú)分裂相的2例為B-ALL，1例FISH結(jié)果同時(shí)合并TEL/AML1。

3.4 BCR/ABL

Ph+ALL病例有高于95%的病例能夠通過(guò)顯帶技術(shù)檢出，其具有潛在隱匿性，因此有必要聯(lián)合FISH共同檢測(cè)[1,6]，用FISH方法還能夠定量監(jiān)測(cè)BCR/ABL基因，進(jìn)行微小殘留?。╩inimal residual disease,MRD）鑒定，進(jìn)行療效判斷以及預(yù)后效果評(píng)估。本研究?jī)煞N檢測(cè)方法均檢出6例BCR/ABL陽(yáng)性病例，均為B-ALL，占總?cè)藬?shù)的4.5%，報(bào)道結(jié)果與一些研究一致，比北京兒童醫(yī)院的5.4%略低，高于英國(guó)兒童，但比其他一些亞洲國(guó)家水平低[9-11]，其中1例染色體存在del（2）（p12），F(xiàn)ISH未檢出，相比于顯帶技術(shù)，F(xiàn)ISH對(duì)染色體內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常的敏感度略低，因此，推薦兩種方法同時(shí)進(jìn)行染色體異常檢測(cè)。

3.5 E2A/PBX1

即TCF3/PBX1，文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)ISH方法對(duì)于該基因的檢測(cè)效果可靠性很高[1]。本研究中，染色體核型篩查出2.3%（3/132）的t（1；19）陽(yáng)性B-ALL，比其他人群發(fā)病率低[8,12]，其中3歲1例，4歲1例，10歲1例，年齡層偏小，由于沒有相應(yīng)的，導(dǎo)致本研究中這種類型的融合基因沒能實(shí)施FISH檢測(cè)。

綜上所述，在兒童急性淋巴細(xì)胞性白血病總體研究中，F(xiàn)ISH異常檢出效果較好。數(shù)量異常最常見的類型為超二倍體，TEL/AML1是最常見結(jié)構(gòu)異常，該研究與國(guó)內(nèi)外其他研究結(jié)果具有一致性[5,12,13]。FISH在ALL中對(duì)染色體數(shù)量、結(jié)構(gòu)異常、異位檢測(cè)均有很高的靈敏度，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)。受到ALL染色體不易分散，標(biāo)本質(zhì)量要求高的限制，因此對(duì)檢測(cè)結(jié)果有一定的影響，而對(duì)于染色體顯帶失敗或結(jié)果正常的情況，可以再此進(jìn)行FISH檢測(cè)，以此提高檢出率[14-16]。