黃 濤，程 璐，莫長(zhǎng)歡，王孝忠，申 杰，皮勁松，龔炎長(zhǎng)

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所∕湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心∕動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.宜昌市畜牧獸醫(yī)中心，湖北 宜昌 443000）

高密度脂蛋白結(jié)合蛋白（HDLBP），最初被認(rèn)為是HDL 受體，位于細(xì)胞表面［1，2］。研究表明，大部分Vigilin 也存在于細(xì)胞質(zhì)中［3-5］。有報(bào)道HDLBP 深入?yún)⑴c了多種生物過(guò)程，如固醇代謝［1，6-8］、致癌過(guò)程［9，10］、翻譯調(diào)控［11，12］、異染色質(zhì)的形成［5，13，14］、tRNA的核輸出［15］、RNA 的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)［16］和特定mRNA 的代謝［17-19］。

極低密度脂蛋白（VLDL）和卵黃蛋白原（VTG）從肝臟分泌到血管中，并轉(zhuǎn)移到卵巢以滿足卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育的要求［20，21］。研究表明，HDLBP 通過(guò)調(diào)節(jié)載脂蛋白B∕Apob mRNA 的翻譯來(lái)調(diào)控VLDL 分泌［22］，提示HDLBP 可能是調(diào)控產(chǎn)蛋的候選基因。雞的HDLBP 基因定位于9 號(hào)染色體，包含29 個(gè)外顯子，其編碼兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別命名為HDLBP-201、HDLBP-202（http：∕∕asia.ensembl.org∕index.html）。本研究分析雞HDLBP基因編碼區(qū)多態(tài)性及與蛋用性能的關(guān)聯(lián)性，探究卵泡顆粒細(xì)胞中HDLBP 扮演角色。

1 材料與方法

1.1 性狀數(shù)據(jù)收集

采集的血樣來(lái)源于欣華雞。在青年雞開產(chǎn)后，記錄33 周齡產(chǎn)蛋數(shù)。此外，第42 周齡時(shí)對(duì)每只雞連續(xù)收集3 枚蛋，用于蛋品質(zhì)測(cè)定，測(cè)定指標(biāo)包括雞蛋重量（EW）、蛋黃重（YW）、哈克單位（HU）、蛋黃顏色（YC）。

1.2 SNP 鑒定與分型

對(duì)采集的血樣用傳統(tǒng)酚氯仿方法抽提DNA，然后用于HDLBP（基因ID：395984）的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增和PCR-RFLP 基因分型，引物序列如表1 所示。10 μL PCR 反應(yīng)體系包括5 μL 2×TaqPCR Master Mix、0.5 μL gDNA 模板（50 ng∕μL）、3.5 μL ddH2O 和上、下游引物（10 pmol∕μL）各0.5 μL。

使用1.5% 瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，并將其送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

用DNASTAR 軟件（http：∕∕www.biologysoft.com∕）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。使用NEBcutter V2.0（http：∕∕nc2.neb.com∕NEBcutter2∕）分 析SNP 的 限 制性內(nèi)切酶。PCR-RFLP 對(duì)個(gè)體的gDNA 進(jìn)行基因分型，使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型。

1.3 RT-qPCR

取產(chǎn)蛋高峰期母雞卵巢，使用TRIzol 試劑（In?vitrogen）提取卵泡顆粒層和膜層總RNA，并用ND-2000（Nano-Drop，USA）評(píng) 估RNA 質(zhì) 量。 使 用PrimeScript RT 試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RTqPCR 所需引物序列：HDLBP：（正向）5"-AGGCT?GTCGCTCGTGTTAAG-3"和（反向）5"-ACTTGTGCT?GGGACTTCTT-3"。GAPDH：（正 向）5"-GAACAT?CATCCCAGCGTCCA -3"和（反向）5"-ACGGCAGGT?CAGGTCAACAA-3"。定量檢測(cè)結(jié)果使用2-ΔΔct方法進(jìn)行分析。

表1 相關(guān)引物序列

1.4 卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的分離與顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

根據(jù)卵泡直徑將卵泡分為小白卵泡（SWF，<3 mm）、大白卵泡（LWF，3～6 mm）、小黃卵泡（SYF，6～8 mm）、大黃卵泡（LYF，8～10 mm）和排卵前卵泡（10～35 mm），并依次命名為F5、F4、F3、F2 和F1。根據(jù)Gilbert 等［23］方法，分離卵泡不同階段的顆粒層和膜層用于RT-qPCR，分離F1-F4 和SYF 的顆粒細(xì)胞用于顆粒細(xì)胞培養(yǎng)。獲得顆粒層后，37 ℃下用0.2% 膠原酶處理5 min 分散顆粒細(xì)胞。離心后將細(xì)胞懸浮于含有2.5%胎牛血清培養(yǎng)基（M199［Gibco］）中，12 孔培養(yǎng)板的接種密度為5×105∕孔。將細(xì)胞培養(yǎng)在37%、5%CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱中6 h，然后用不同濃度的重組人卵泡刺激素（FSH）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、卵泡抑素（Fol?listatin），培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于基因的表達(dá)分析。

1.5 關(guān)聯(lián)分析

使用混合線性模型（SAS 9.2）進(jìn)行單倍型與雞蛋用性能的關(guān)聯(lián)分析：

式中，Ehijk是個(gè)體觀察值，μ是總體均值，Gh為單倍型效應(yīng)，Si為父本效應(yīng)，D（s）jk為父本內(nèi)母本效應(yīng)，εijkl為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 C3381T 和T387C 與AFE 和EW 顯著關(guān)聯(lián)

在HDLBP基因中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)SNPs，所有SNP 均未引起氨基酸改變，其堿基突變位置參照NM_205096.2 序列見表2。利用限制性內(nèi)切酶對(duì)其中5個(gè)SNP 進(jìn)行酶切分型，分型結(jié)果用于蛋用性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果（表3）表明，C3381T 和T387C 與AFE和EW 顯著關(guān)聯(lián)（P<0.05）。

表2 在HDLBP 基因中鑒定6 個(gè)SNPs（NM_205096.2）

2.2 HDLBP 基因在卵泡顆粒層和膜層中表達(dá)情況

不同直徑大小卵泡中HDLBPmRNA 的表達(dá)變化如圖1 所示。從SWF 到SYF，HDLBP基因表達(dá)水平在膜層和顆粒層中逐漸升高。在排卵前期，F(xiàn)3到F2 的顆粒層中HDLBPmRNA 水平顯著（P<0.05）下降。膜層中HDLBPmRNA 保持相對(duì)較穩(wěn)定的水平，在卵泡排卵后POF-1 和POF-2 膜層中呈下降趨勢(shì)。

圖1 不同直徑卵泡中HDLBP mRNA 相對(duì)表達(dá)量（n=4）

表3 C3381T 和T387C 與蛋用性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

2.3 顆粒細(xì)胞中外源激素對(duì)HDLBP基因的調(diào)控研究

從SYF 和F1-F4 中分別分離顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并研究FSH、EGF、VEGF 和Follistatin 是否能調(diào)節(jié)HDLBP基因的表達(dá)。結(jié)果表明，在SYF 顆粒細(xì)胞中，EGF 以50 ng∕mL 的濃度顯著激活HDLBP基因的轉(zhuǎn)錄（P<0.05），然而在F1-F4 顆粒細(xì)胞中，它抑制HDLBP基因的表達(dá)（圖2A）；在SYF 顆粒細(xì)胞和F1-F4 顆粒細(xì)胞中，5 ng∕mL VEGF 都顯著激活HDLBP轉(zhuǎn)錄（P<0.05），當(dāng)VEGF 的濃度增加到50 ng ∕mL，F(xiàn)1-F4 顆粒細(xì)胞中HDLBP轉(zhuǎn)錄再次被激活（圖2B）；50 ng∕mL FSH 僅在SYF 顆粒細(xì)胞中，顯著激活HDLBP轉(zhuǎn)錄（P<0.05）（圖2C）；Follistatin 處理顆粒細(xì)胞后，未發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異（圖2D）。

3 小結(jié)與討論

本研究在雞HDLBP基因中鑒定6 個(gè)同義突變，并與雞蛋用性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3381T 和T387C 與AFE 和EW 顯著關(guān)聯(lián)，推測(cè)這些位點(diǎn)雖然未能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，有可能參與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合或非編碼序列的調(diào)控，從而介導(dǎo)產(chǎn)蛋的調(diào)控通路。

HDLBP 在內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源的器官中普遍表達(dá)最高，如肝臟。肝臟是卵黃前體物質(zhì)合成的主要場(chǎng)所，其中極低密度脂蛋白（VLDL）是蛋黃前體物質(zhì)之一［24］。研究表明,HDLBP 通過(guò)調(diào)節(jié)載脂蛋白B∕Apob mRNA 翻譯來(lái)調(diào)控VLDL 分泌［22］。但在卵泡發(fā)育過(guò)程中，HDLBP 的作用和功能未有報(bào)道。

為探討其在卵泡發(fā)育中的作用，使用EGF、VEGF、FSH、卵泡抑素處理不同階段的顆粒細(xì)胞，以探究其對(duì)HDLBP表達(dá)的影響，這4 種激素在卵泡發(fā)育過(guò)程中都至關(guān)重要。FSH 調(diào)節(jié)雌性卵泡生長(zhǎng)［25］，刺 激 卵 泡 顆 粒 細(xì) 胞17β 雌 二 醇 和 孕 酮 生成［26］。VEGF 可為卵泡發(fā)育提供必要成分，確保其從原始卵泡轉(zhuǎn)變?yōu)榕怕亚奥雅荩?7］。VEGF 和EGF配體∕受體參與細(xì)胞增殖和存活［28，29］。顆粒細(xì)胞中Follistatin 的失活導(dǎo)致雌性生育力喪失［30］。本研究發(fā)現(xiàn)EGF、VEGF、FSH 在不同顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)階段對(duì)HDLBP 調(diào)控具有劑量依賴性，F(xiàn)ollistatin 對(duì)HDLBPmRNA 表達(dá)沒(méi)有明顯影響。

在雞HDLBP基因中，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNPs 與開產(chǎn)日齡和蛋重有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HDLBP在卵泡發(fā)育過(guò)程中受到EGF、FSH、VEGF 的調(diào)控，表明HDLBP是介導(dǎo)蛋用性能的候選基因。