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        雞HDLBP 基因SNP 鑒定及其與蛋用性能關(guān)聯(lián)分析

        2021-01-21 09:18:42莫長歡王孝忠皮勁松龔炎長
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年24期
        關(guān)鍵詞:顆粒細(xì)胞卵泡關(guān)聯(lián)

        黃 濤,程 璐,莫長歡,王孝忠,申 杰,皮勁松,龔炎長

        (1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所∕湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心∕動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;3.宜昌市畜牧獸醫(yī)中心,湖北 宜昌 443000)

        高密度脂蛋白結(jié)合蛋白(HDLBP),最初被認(rèn)為是HDL 受體,位于細(xì)胞表面[1,2]。研究表明,大部分Vigilin 也存在于細(xì)胞質(zhì)中[3-5]。有報(bào)道HDLBP 深入?yún)⑴c了多種生物過程,如固醇代謝[1,6-8]、致癌過程[9,10]、翻譯調(diào)控[11,12]、異染色質(zhì)的形成[5,13,14]、tRNA的核輸出[15]、RNA 的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[16]和特定mRNA 的代謝[17-19]。

        極低密度脂蛋白(VLDL)和卵黃蛋白原(VTG)從肝臟分泌到血管中,并轉(zhuǎn)移到卵巢以滿足卵泡生長和發(fā)育的要求[20,21]。研究表明,HDLBP 通過調(diào)節(jié)載脂蛋白B∕Apob mRNA 的翻譯來調(diào)控VLDL 分泌[22],提示HDLBP 可能是調(diào)控產(chǎn)蛋的候選基因。雞的HDLBP 基因定位于9 號(hào)染色體,包含29 個(gè)外顯子,其編碼兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本,分別命名為HDLBP-201、HDLBP-202(http:∕∕asia.ensembl.org∕index.html)。本研究分析雞HDLBP基因編碼區(qū)多態(tài)性及與蛋用性能的關(guān)聯(lián)性,探究卵泡顆粒細(xì)胞中HDLBP 扮演角色。

        1 材料與方法

        1.1 性狀數(shù)據(jù)收集

        采集的血樣來源于欣華雞。在青年雞開產(chǎn)后,記錄33 周齡產(chǎn)蛋數(shù)。此外,第42 周齡時(shí)對(duì)每只雞連續(xù)收集3 枚蛋,用于蛋品質(zhì)測定,測定指標(biāo)包括雞蛋重量(EW)、蛋黃重(YW)、哈克單位(HU)、蛋黃顏色(YC)。

        1.2 SNP 鑒定與分型

        對(duì)采集的血樣用傳統(tǒng)酚氯仿方法抽提DNA,然后用于HDLBP(基因ID:395984)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和PCR-RFLP 基因分型,引物序列如表1 所示。10 μL PCR 反應(yīng)體系包括5 μL 2×TaqPCR Master Mix、0.5 μL gDNA 模板(50 ng∕μL)、3.5 μL ddH2O 和上、下游引物(10 pmol∕μL)各0.5 μL。

        使用1.5% 瓊脂糖凝膠檢測PCR 產(chǎn)物,并將其送至武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司進(jìn)行測序。

        用DNASTAR 軟件(http:∕∕www.biologysoft.com∕)對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)。使用NEBcutter V2.0(http:∕∕nc2.neb.com∕NEBcutter2∕)分 析SNP 的 限 制性內(nèi)切酶。PCR-RFLP 對(duì)個(gè)體的gDNA 進(jìn)行基因分型,使用2.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型。

        1.3 RT-qPCR

        取產(chǎn)蛋高峰期母雞卵巢,使用TRIzol 試劑(In?vitrogen)提取卵泡顆粒層和膜層總RNA,并用ND-2000(Nano-Drop,USA)評(píng) 估RNA 質(zhì) 量。 使 用PrimeScript RT 試劑盒對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RTqPCR 所需引物序列:HDLBP:(正向)5"-AGGCT?GTCGCTCGTGTTAAG-3"和(反向)5"-ACTTGTGCT?GGGACTTCTT-3"。GAPDH:(正 向)5"-GAACAT?CATCCCAGCGTCCA -3"和(反向)5"-ACGGCAGGT?CAGGTCAACAA-3"。定量檢測結(jié)果使用2-ΔΔct方法進(jìn)行分析。

        表1 相關(guān)引物序列

        1.4 卵泡顆粒細(xì)胞與膜細(xì)胞的分離與顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)

        根據(jù)卵泡直徑將卵泡分為小白卵泡(SWF,<3 mm)、大白卵泡(LWF,3~6 mm)、小黃卵泡(SYF,6~8 mm)、大黃卵泡(LYF,8~10 mm)和排卵前卵泡(10~35 mm),并依次命名為F5、F4、F3、F2 和F1。根據(jù)Gilbert 等[23]方法,分離卵泡不同階段的顆粒層和膜層用于RT-qPCR,分離F1-F4 和SYF 的顆粒細(xì)胞用于顆粒細(xì)胞培養(yǎng)。獲得顆粒層后,37 ℃下用0.2% 膠原酶處理5 min 分散顆粒細(xì)胞。離心后將細(xì)胞懸浮于含有2.5%胎牛血清培養(yǎng)基(M199[Gibco])中,12 孔培養(yǎng)板的接種密度為5×105∕孔。將細(xì)胞培養(yǎng)在37%、5%CO2的無菌培養(yǎng)箱中6 h,然后用不同濃度的重組人卵泡刺激素(FSH)、表皮生長因子(EGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、卵泡抑素(Fol?listatin),培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞用于基因的表達(dá)分析。

        1.5 關(guān)聯(lián)分析

        使用混合線性模型(SAS 9.2)進(jìn)行單倍型與雞蛋用性能的關(guān)聯(lián)分析:

        式中,Ehijk是個(gè)體觀察值,μ是總體均值,Gh為單倍型效應(yīng),Si為父本效應(yīng),D(s)jk為父本內(nèi)母本效應(yīng),εijkl為隨機(jī)誤差效應(yīng)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 C3381T 和T387C 與AFE 和EW 顯著關(guān)聯(lián)

        在HDLBP基因中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)SNPs,所有SNP 均未引起氨基酸改變,其堿基突變位置參照NM_205096.2 序列見表2。利用限制性內(nèi)切酶對(duì)其中5個(gè)SNP 進(jìn)行酶切分型,分型結(jié)果用于蛋用性狀的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果(表3)表明,C3381T 和T387C 與AFE和EW 顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。

        表2 在HDLBP 基因中鑒定6 個(gè)SNPs(NM_205096.2)

        2.2 HDLBP 基因在卵泡顆粒層和膜層中表達(dá)情況

        不同直徑大小卵泡中HDLBPmRNA 的表達(dá)變化如圖1 所示。從SWF 到SYF,HDLBP基因表達(dá)水平在膜層和顆粒層中逐漸升高。在排卵前期,F(xiàn)3到F2 的顆粒層中HDLBPmRNA 水平顯著(P<0.05)下降。膜層中HDLBPmRNA 保持相對(duì)較穩(wěn)定的水平,在卵泡排卵后POF-1 和POF-2 膜層中呈下降趨勢。

        圖1 不同直徑卵泡中HDLBP mRNA 相對(duì)表達(dá)量(n=4)

        表3 C3381T 和T387C 與蛋用性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

        2.3 顆粒細(xì)胞中外源激素對(duì)HDLBP基因的調(diào)控研究

        從SYF 和F1-F4 中分別分離顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),并研究FSH、EGF、VEGF 和Follistatin 是否能調(diào)節(jié)HDLBP基因的表達(dá)。結(jié)果表明,在SYF 顆粒細(xì)胞中,EGF 以50 ng∕mL 的濃度顯著激活HDLBP基因的轉(zhuǎn)錄(P<0.05),然而在F1-F4 顆粒細(xì)胞中,它抑制HDLBP基因的表達(dá)(圖2A);在SYF 顆粒細(xì)胞和F1-F4 顆粒細(xì)胞中,5 ng∕mL VEGF 都顯著激活HDLBP轉(zhuǎn)錄(P<0.05),當(dāng)VEGF 的濃度增加到50 ng ∕mL,F(xiàn)1-F4 顆粒細(xì)胞中HDLBP轉(zhuǎn)錄再次被激活(圖2B);50 ng∕mL FSH 僅在SYF 顆粒細(xì)胞中,顯著激活HDLBP轉(zhuǎn)錄(P<0.05)(圖2C);Follistatin 處理顆粒細(xì)胞后,未發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異(圖2D)。

        3 小結(jié)與討論

        本研究在雞HDLBP基因中鑒定6 個(gè)同義突變,并與雞蛋用性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3381T 和T387C 與AFE 和EW 顯著關(guān)聯(lián),推測這些位點(diǎn)雖然未能改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),有可能參與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合或非編碼序列的調(diào)控,從而介導(dǎo)產(chǎn)蛋的調(diào)控通路。

        HDLBP 在內(nèi)皮細(xì)胞來源的器官中普遍表達(dá)最高,如肝臟。肝臟是卵黃前體物質(zhì)合成的主要場所,其中極低密度脂蛋白(VLDL)是蛋黃前體物質(zhì)之一[24]。研究表明,HDLBP 通過調(diào)節(jié)載脂蛋白B∕Apob mRNA 翻譯來調(diào)控VLDL 分泌[22]。但在卵泡發(fā)育過程中,HDLBP 的作用和功能未有報(bào)道。

        為探討其在卵泡發(fā)育中的作用,使用EGF、VEGF、FSH、卵泡抑素處理不同階段的顆粒細(xì)胞,以探究其對(duì)HDLBP表達(dá)的影響,這4 種激素在卵泡發(fā)育過程中都至關(guān)重要。FSH 調(diào)節(jié)雌性卵泡生長[25],刺 激 卵 泡 顆 粒 細(xì) 胞17β 雌 二 醇 和 孕 酮 生成[26]。VEGF 可為卵泡發(fā)育提供必要成分,確保其從原始卵泡轉(zhuǎn)變?yōu)榕怕亚奥雅荩?7]。VEGF 和EGF配體∕受體參與細(xì)胞增殖和存活[28,29]。顆粒細(xì)胞中Follistatin 的失活導(dǎo)致雌性生育力喪失[30]。本研究發(fā)現(xiàn)EGF、VEGF、FSH 在不同顆粒細(xì)胞生長階段對(duì)HDLBP 調(diào)控具有劑量依賴性,F(xiàn)ollistatin 對(duì)HDLBPmRNA 表達(dá)沒有明顯影響。

        在雞HDLBP基因中,發(fā)現(xiàn)2 個(gè)SNPs 與開產(chǎn)日齡和蛋重有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),HDLBP在卵泡發(fā)育過程中受到EGF、FSH、VEGF 的調(diào)控,表明HDLBP是介導(dǎo)蛋用性能的候選基因。

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