李陽，張麗珍*，甄曉君，柳青山，張一中

(1.山西大學 生命科學學院，太原 030006；2.山西圣堂食品科技有限公司，山西 長治 047500；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院高粱研究所，山西 晉中 030600)

食醋在我國有著悠久的釀造歷史[1]，口感綿香，營養(yǎng)豐富[2]，更有殺菌、降血壓等功效[3-4]，是一種暢銷的酸味調(diào)味料。食醋種類繁多，口味獨特，深受消費者喜歡[5]。傳統(tǒng)食醋的釀造方法是將糧食蒸煮后，加入大曲進行發(fā)酵[6]，最先出現(xiàn)于山西省長治市的生料醋，與傳統(tǒng)醋的主要區(qū)別是原料不需蒸煮，直接加入發(fā)酵劑進行發(fā)酵[7]，微生物種類更多，口感也更加醇和，因其可節(jié)省大量的勞動力與蒸煮設(shè)備，現(xiàn)已被越來越多的釀醋工廠關(guān)注。

目前多數(shù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化集中在果醋釀造[8-10]，對生料醋的研究局限于發(fā)展前景[11]、真菌多樣性的分析[12]。巴氏醋桿菌是食醋發(fā)酵過程中一種重要的醋酸菌，多數(shù)學者主要圍繞菌株的發(fā)酵生長[13-14]，對酸、醇的耐受情況展開探究[15]，針對生料醋醅中巴氏醋桿菌的發(fā)酵優(yōu)化未見報道。已有研究結(jié)果得出，從生料醋醅中篩選出5株醋酸菌經(jīng)生物學鑒定均為巴氏醋桿菌，但其發(fā)酵性能各有不同，因此研究生料醋醅中巴氏醋桿菌的發(fā)酵特性，對于深入了解生料釀醋與熟料釀醋在發(fā)酵上的差異具有指導意義。有機酸是評價食醋風味的重要指標[16]，決定了食醋的品質(zhì)和感官特性[17]，利用高效液相色譜法對有機酸進行檢測也尤為重要[18]。本文以生料醋醅中篩選出的巴氏醋桿菌L3為菌種，通過響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵條件，分析發(fā)酵液中有機酸的組成與含量，為生料醋釀造工藝的改進及品質(zhì)把控提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巴氏醋桿菌L3：從山西長治某醋廠生料醋醅中分離獲得，鑒定為巴氏醋桿菌后編號L3于-80 ℃超低溫冰箱中保藏備用；無水葡萄糖：山東西亞化學工業(yè)有限公司；硫酸鎂：天津市北辰方正試劑廠；酵母粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；無水乙醇(分析純)：天津歐博凱化工有限公司；磷酸二氫鉀、甲醇、乳酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸(色譜純，純度>99%)：Aladdin公司。

AD-88大容量全溫氣浴振蕩器 常州國宇儀器制造有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ME204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；PHS-3C型pH計 雷磁儀器廠；Agilent 1260 Infinity II液相色譜儀 費爾伯恩精密儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母粉10 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，水1000 mL，于0.1 MPa、121 ℃滅菌27 min。使用前加入4%無水乙醇。

1.2.2 醋酸菌的活化

將保存于-80 ℃超低溫冰箱中的巴氏醋桿菌L3解凍后接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r/min的全溫氣浴振蕩器中振蕩培養(yǎng)24 h，然后從該發(fā)酵培養(yǎng)基中以2%的接種量接種于新的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，活化完成。菌液按不同的接種量接種于后續(xù)試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基中。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

1.2.3.1 初始乙酸量對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的影響

影響醋酸菌發(fā)酵的因素有通氧量、溫度、初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接種量等，由于通氧量、溫度試驗對振蕩培養(yǎng)箱數(shù)量要求較高，結(jié)合自身實驗室所具備的試驗條件，選擇初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接種量3個試驗因素研究對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的影響。已通過預試驗得出巴氏醋桿菌在發(fā)酵第5天時總酸含量達到最高，為保證數(shù)據(jù)的準確性，試驗將巴氏醋桿菌在37 ℃下培養(yǎng)9 d，每天取樣檢測發(fā)酵液中總酸含量，以期確定合適的發(fā)酵條件，進一步優(yōu)化巴氏醋桿菌的發(fā)酵。

在裝液量為25 mL/100 mL，接種量為2%，初始乙醇量為4%，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)9 d的條件下，考察初始乙酸量0.5%、1%、1.5%、2%、3%對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.3.2 初始乙醇量對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的影響

在裝液量為25 mL/100 mL，接種量2%，初始乙酸量為2%，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)9 d的條件下，考察初始乙醇量2%、3%、4%、6%、8%對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.3.3 接種量對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的影響

在裝液量為25 mL/100 mL，初始乙酸量為2%，初始乙醇量為4%，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)9 d的條件下，考察接種量2%、3%、4%、5%、6%對生料醋醅中巴氏醋桿菌發(fā)酵的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗的設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，以37 ℃發(fā)酵5 d的總酸(g/L)為響應(yīng)值，選擇初始乙酸量(%)、初始乙醇量(%)、醋酸菌接種量(%)進行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗，確定最優(yōu)發(fā)酵條件[19-20]。因素和水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平方案設(shè)計表Table 1 The factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5 優(yōu)化前后發(fā)酵液中有機酸的測定

優(yōu)化發(fā)酵條件前，巴氏醋桿菌的發(fā)酵條件為初始乙酸量0%、初始乙醇量4%、醋酸菌接種量2%、溫度37 ℃。為了更深入地了解發(fā)酵條件對巴氏醋桿菌發(fā)酵的影響，將發(fā)酵條件未優(yōu)化和已優(yōu)化的發(fā)酵液在37 ℃下各培養(yǎng)5 d，檢測優(yōu)化前和優(yōu)化后兩種發(fā)酵液中有機酸的種類和含量，考察發(fā)酵條件對有機酸生成的影響。

1.2.6 測定指標1.2.6.1 總酸的測定

總酸(以醋酸計，g/L)的測定參照GB/T 5009.41-2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》。

1.2.6.2 有機酸的測定

產(chǎn)酸高效液相色譜檢測條件參照楊鈺昆等的測定方法[21]。色譜柱：Supersil AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇∶0.02 mol/L磷酸二氫鉀體積比為3∶97(磷酸調(diào)pH至2.7)；流速：1.00 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL。

有機酸混標液：分別稱取草酸、乳酸、乙酸各0.01 g，檸檬酸、琥珀酸各0.02 g，定容至10 mL，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｒ圆煌倪M樣濃度為橫坐標，對應(yīng)不同的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗均重復3次，結(jié)果取平均值。利用SPSS 20和Excel 2003分析數(shù)據(jù)并制作圖表，Design-Expert V8.0.6設(shè)計響應(yīng)面試驗方案及數(shù)據(jù)的處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始乙酸量對總酸含量的影響

圖1 初始乙酸量對總酸的影響Fig.1 Effect of initial acetic acid amount on total acid content

由圖1可知，總酸呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，發(fā)酵液總酸在發(fā)酵5 d后趨于穩(wěn)定。乙酸添加量從0.5%增加到1.5%時，總酸含量明顯增加；添加量為2%時，總酸含量在第5天達到最大，為47.22 g/L；當乙酸添加量超過2%，總酸量開始降低。添加適量的乙酸會促進乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶的生成[22]，適當?shù)乃嵝原h(huán)境也有利于醋酸菌的生長，乙酸含量過高，酸度過高，反而抑制了醋酸菌的活性。

2.1.2 初始乙醇量對總酸含量的影響

圖2 初始乙醇量對總酸的影響Fig.2 Effect of initial ethanol amount on total acid content

由圖2可知，醋酸菌有較好的乙醇耐受性，在發(fā)酵5 d時，發(fā)酵液中總酸達到最大，隨著發(fā)酵時間的延長，總酸在第9天略微降低，可能是發(fā)酵后期碳源供應(yīng)不足，發(fā)生了過氧化乙酸的現(xiàn)象[23]。乙醇作為醋酸菌的直接碳源，含量過低時(2%)不能滿足菌株對碳源的需求，過高時則會抑制菌株的發(fā)酵[24]，因此不適當?shù)囊掖己慷疾焕谄渖L。初始乙醇量為4%時總酸含量在發(fā)酵第5天達到最高，為47.40 g/L。

2.1.3 醋酸菌接種量對總酸含量的影響

圖3 醋酸菌接種量對總酸的影響Fig.3 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on total acid content

在發(fā)酵過程中，醋酸菌的主要作用是氧化乙醇生成醋酸，接種量的多少直接影響到最終的產(chǎn)酸量[25]。由圖3可知，發(fā)酵5 d左右產(chǎn)酸量達到最大且基本穩(wěn)定。接種量過低，酒精不能發(fā)酵完全，過高時發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量菌體的生長，醋酸菌會出現(xiàn)自溶和提前老化等現(xiàn)象，產(chǎn)酸量也相對較低[26]。綜合可知接種量為4%時醋酸菌產(chǎn)酸最高，在發(fā)酵第5天時達到最高，為47.64 g/L。

2.2 巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 二次回歸方程的建立與方差分析

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，得出X1(初始乙酸量)2%、X2(初始乙醇量)4%、X3(醋酸菌接種量)4%，發(fā)酵5 d時，總酸最高。利用Design-Expert V8.0.6軟件以發(fā)酵5 d的總酸為響應(yīng)值，設(shè)計三因素三水平共17組(5個中心點)的響應(yīng)面試驗，設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and test results of response surface analysis

對表2的結(jié)果進行回歸分析，得到總酸對初始乙酸量、初始乙醇量、接種量的二次回歸方程：Y=46.41+2.66X1+5.27X2+0.9X3-3.89X1X2-1.25X1X3-0.092X2X3-2.15X12-5.73X22-2.09X32。

對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) for response surface model

由表3可知，該模型的F值為100.06，P<0.0001，說明該模型為極顯著水平，模型成立。決定系數(shù)R2為0.9923，P失擬項為0.0547>0.05，F(xiàn)失擬項為6.23，表明該模型擬合良好，未知因素干擾較小，回歸方程合理可信，適用于巴氏醋桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化。一次項X1、X2，交互項X1X2，二次項X12、X22、X32對總酸的影響極顯著(P<0.01)；一次項X3，交互項X1X3對總酸的影響顯著(P<0.05)；X2X3的影響不顯著。根據(jù)各因素的F值大小可以得出：初始乙醇量對發(fā)酵液中總酸的影響最大，初始乙酸量次之，接種量的影響最小。

2.2.2 發(fā)酵條件的響應(yīng)面分析及優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面法所得的圖形是指特定的響應(yīng)值總酸(Y)與相對應(yīng)的因素X1、X2、X3構(gòu)成的3D立體圖，將一個因素固定為零水平，分析另外兩因素的相互作用，由圖4可知各因素交互作用的顯著性[27]，通過分析等高線圖可得出最優(yōu)條件下的取值范圍。初始乙酸量、初始乙醇量、醋酸菌接種量3個因素兩兩交互對巴氏醋桿菌總酸的影響結(jié)果見圖4。

圖4 響應(yīng)面分析因素間交互作用對總酸的影響Fig.4 Response surface analysis of the effect of interactions among independent variables on total acid content

圖5 實際值與預測值的擬合性Fig.5 The fitting of actual values and predicted values

由初始乙酸量和初始乙醇量的響應(yīng)面圖(見圖4中a)可知，響應(yīng)曲面陡峭，等高線呈橢圓形，說明這兩個因素的交互作用對總酸的影響極顯著(P<0.01)。由初始乙醇量和醋酸菌接種量的響應(yīng)面圖(見圖4中b)可知，響應(yīng)曲面呈拋物線形，等高線密集，說明這一組合對總酸的影響顯著(P<0.05)。由初始乙酸量和醋酸菌接種量的響應(yīng)面圖(見圖4中c)可知，響應(yīng)曲面坡度降低，等高線密集度也降低，說明總酸受到初始乙酸量和醋酸菌接種量的交互影響，但趨勢降低。該結(jié)論與表3的方差分析結(jié)果一致。由圖5可知，實際值和預測值的擬合度較高，證明此次試驗結(jié)果真實可靠。

2.2.3 驗證試驗

為驗證響應(yīng)面的分析結(jié)果，對上述回歸方程進行分析，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為初始乙酸量2.12%，初始乙醇量4.38%，醋酸菌接種量4.14%，此條件下總酸可達49.78 g/L，考慮實際試驗操作的可行性，將條件調(diào)整為初始乙酸量2%，初始乙醇量4.5%，醋酸菌接種量4%，3次平行試驗后得到總酸的平均值為48.65 g/L，與理論值誤差不超過5%，證明該模型能夠較好地優(yōu)化生料醋醅中巴氏醋桿菌的發(fā)酵條件，該方法實用可靠。

2.3 有機酸的檢測

2.3.1 有機酸標樣的色譜圖

草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸5種有機酸標準品混合溶液的液相色譜圖見圖6。

圖6 有機酸混合標準溶液色譜圖Fig.6 Chromatogram of organic acid mixed standard solution

由圖6可知，5種有機酸在10 min內(nèi)完全分離，且峰形較好。

對發(fā)酵液中的有機酸進行液相色譜分析，見圖7。朱其瀚[28]從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選出一株巴氏醋桿菌，經(jīng)測定可產(chǎn)乳酸、乙酸、酒石酸3種有機酸，相比之下，生料醋中有機酸的種類更豐富，因此口感更為獨特。

圖7 發(fā)酵液有機酸色譜圖Fig.7 Chromatogram of organic acids in fermentation broth

2.3.2 線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)

按照1.2.6所述方法對5種標準有機酸進行線性回歸分析，見表4。所得標準曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.998，表明線性關(guān)系良好，該方法可以用于5種有機酸的測定。

表4 有機酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 4 The regression equations and correlation coefficients

2.3.3 有機酸的分析結(jié)果

對發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，檢測發(fā)酵第5天的有機酸種類與含量，與優(yōu)化前(發(fā)酵溫度37 ℃，初始乙酸量0%，初始乙醇量4%，醋酸菌接種量2%)的檢測結(jié)果進行對比，結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵液中有機酸種類與含量Table 5 The types and content of organic acids in fermentation broth

由表5可知，優(yōu)化后含量顯著增加的有機酸為乙酸，與優(yōu)化前相比增加了29.65 g/L，是食醋中的主要呈味物質(zhì)，乳酸產(chǎn)量也略有增加，由1.75 g/L增加到2.80 g/L，草酸、檸檬酸、琥珀酸產(chǎn)量沒有明顯變化，分別是0.08，0.17，0.47 g/L，這4類難揮發(fā)的有機酸可減輕乙酸的刺激性口感[29]，與乙酸共同構(gòu)成了食醋酸爽醇香的風味特征。

3 結(jié)論

本試驗以生料醋醅中獲得的巴氏醋桿菌為研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面法對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，經(jīng)分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始乙酸量2%，初始乙醇量4.5%，醋酸菌接種量4%，此條件下總酸可達48.65 g/L。對此條件下的有機酸進行檢測，分析了乙酸、草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸5種有機酸，與優(yōu)化前有顯著差異的為乙酸，優(yōu)化后可達37.60 g/L，其余質(zhì)量濃度分別是0.08，2.80，0.17，0.47 g/L，這些有機酸中和了乙酸的刺激感，使食醋的口感更加柔和。