方桂任，劉 輝，林振孟 (福建省腫瘤醫(yī)院，福建醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院頭頸腫瘤外科，福建 福州 350014)

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，2018年全球總發(fā)病率約為18萬，死亡人數(shù)約為8萬[1]。盡管當前整體治療水平有所提高，但喉癌的總體生存率仍較差。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個非常復雜的過程，揭示喉癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制有利于開發(fā)喉癌新的治療藥物。p62/SQSTM1(以下稱p62)是一種多功能的銜接蛋白，作為自噬的選擇性底物[2]，在胃癌[3]、肝細胞癌[4]、乳腺癌[5]中均發(fā)現(xiàn)p62的異常積聚，本文探討自噬相關蛋白p62在喉癌組織中的表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2010年1月～2015年4月于福建省腫瘤醫(yī)院行喉癌手術患者作為研究對象，納入標準包括：①根治性手術；②病理明確為鱗癌；③臨床病理資料完整，隨訪可靠。排除標準：①術前新輔助化療；②合并其他部位惡性腫瘤；③術后30 d內死亡。共有115例患者納入研究，采用免疫組化檢測喉癌組織及癌旁正常組織石蠟標本p62蛋白表達水平。另一方面，收集2018年1月～2019年8月我院25例新鮮喉癌組織標本放入-80℃冰箱保存，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western Blot)檢測冷凍保存標本中p62mRNA及蛋白的表達水平。本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2主要試劑:p62單克隆抗體購自美國Abcam公司，RNA分離試劑盒Trizol、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒購自日本Takara 公司。蛋白質印跡法(Western blot)所用試劑及蛋白裂解液盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1免疫組化SP法:將石蠟組織以4 μm厚連續(xù)切片，65℃烤箱烘片30 min，脫蠟、水化、阻斷過氧化物酶活性、修復抗原，山羊血清封閉液封閉后加入鼠抗人p62一抗，4℃過夜，加入二抗、DAB染色、復染、脫水后顯微鏡下觀察。染色強度分級:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分。陽性細胞數(shù)分級:陽性細胞數(shù)≤50%為0分,陽性細胞數(shù)51%～75% 為1分,陽性細胞數(shù)≥76%為2分。兩項得分相加,3～4分為高表達,0～2分為低表達。

1.3.2實時熒光定量PCR(RT-PCR)：采用Trizol試劑盒提取并純化新鮮標本mRNA，根據(jù)逆轉錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉錄和擴增，反應條件：95 ℃預變性10min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸45 s，72℃60 s延伸，共40個循環(huán)。p62上游引物序列：5′- AGCTGCCCTCAGCCCTCTA-3′，下游引物序列:5′- GGCTTCTCTTCCCTCCATGTT-3′?？醇一騁APDH上游引物序列：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列：5′-TCCACCACCCTGTrGCTGTA-3′。

1.3.3蛋白質印跡法：充分研磨并裂解組織，采用BCA法測蛋白濃度。取30 μg蛋白進行上樣、電泳、轉膜、封閉，加p62單克隆抗體(稀釋比例1∶1 000)4℃孵育過夜，相應二抗(稀釋比例1∶000)室溫孵育1 h，以GAPDH作為內參。

2 結果

圖1 p62在喉癌組織中表達陽性(×10)

2.1p62在喉癌組織中的表達情況:免疫組化中，p62蛋白定位于細胞質中，p62在喉癌石蠟組織中表達陽性率為56.5%(65/115)，高于癌旁正常組織的23.5%(27/115)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、圖2。在新鮮冰凍組織中，RT-PCR結果擴增曲線呈S形，溶解曲線呈單峰，說明結果可靠，見圖3、圖4。p62mRNA在喉癌表達水平[ΔCT值為(2.814±1.156)]高于癌旁正常組織[ΔCT值為(1.632±1.061)]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western blot結果顯示：喉癌組織中p62蛋白表達水平(0.812±0.421)高于癌旁正常組織(0.501±0.311)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖2 p62在癌旁正常組織中表達陰性(×10)

圖3 p62擴增曲線

圖4 p62的溶解曲線

圖5 1-3：喉癌組織，4-6：癌旁正常組織

2.2p62與臨床病理資料及預后的關系:p62的表達與年齡、性別、吸煙、臨床分型、腫瘤大小、分化程度、手術方式無關(P>0.05)；與喉癌的浸潤深度、淋巴結轉移、病理分期有關(P<0.05)，見表1。p62陽性患者的5年生存率為36.1%，低于p62陰性患者的62.6%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。見圖6。

表1 p62與臨床病理特征的關系

圖6 p62陽性和陰性的生存曲線

3 討論

自噬是生物在進化中保守的細胞內分解代謝過程，在這個過程中，自噬底物(細胞質大分子、聚集蛋白、受損細胞器或病原體)被運送到溶酶體，并被溶酶體水解消化產生核苷酸、氨基酸、脂肪酸、葡萄糖和ATP，最終循環(huán)到細胞質。這種由溶酶體介導的細胞自我消化一方面維持細胞在饑餓和應激期間的新陳代謝和生存，另一方面消除受損的蛋白質和細胞器，以保持蛋白質和細胞器的質量和數(shù)量平衡[6]。p62是應激誘導蛋白，作為非典型蛋白激酶C(PKC)、細胞外信號調節(jié)激酶1 (ERK1)、核因子-JB和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)的支架蛋白已被廣泛研究，越來越多證據(jù)表明，在氧化應激反應以及泛素化的自噬受體中發(fā)揮著巨大的作用[7]。p62具有多個結構域，包括Phox1和Bem1p(PB1)結構域、鋅指(ZZ)、兩個核定位信號、一個腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)結合域、一個核輸出信號、一個LC3相互作用區(qū)(LIR)、一個Keap1相互作用區(qū)(KIR)和一個泛素相關(UBA)結構域,不同的結構域與各個受體相互結合從而發(fā)揮多種作用[8]。微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)在自噬中發(fā)揮多種作用，包括自噬泡膜形成、轉運自噬底物和自噬小體運輸，是自噬體的標志性分子[9]。p62中的LIR結構域與LC3上多個位點相互作用，將泛素化的自噬底物遞送溶酶體中，進而與溶酶體結合，促使底物被選擇性自噬。此外，p62是哺乳動物溶酶體激活的信號樞紐，也是激活自噬底物上Keap1-Nrf2信號通路樞紐，在選擇性自噬中扮演著特定且不可或缺的角色[10]。

本研究中，p62與喉癌的浸潤深度、淋巴結轉移、病理分期有關，其陽性預示著患者的不良預后，表明p62促進腫瘤的生長及發(fā)展。癌細胞與所處的內外環(huán)境有著密切關系，稱為腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境是近年來出現(xiàn)的新興概念，已成為腫瘤研究的一個重要標志，腫瘤微環(huán)境通過提供營養(yǎng)物質使腫瘤細胞能夠存活，由自噬介導的腫瘤微環(huán)境可能在調節(jié)腫瘤的發(fā)展、轉移和治療耐藥中發(fā)揮重要作用，自噬與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用越來越引起人們的關注。自噬可以由腫瘤微環(huán)境中的幾種應激源誘導，同時自噬也可以改變腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境的生理特征明顯不同于正常組織，由于腫瘤細胞快速生長，血管生成不足無法輸送充足的氧氣及能量至整個腫瘤，所以腫瘤微環(huán)境表現(xiàn)為缺氧、缺乏營養(yǎng)及能量、酸性和炎性反應[11]。越來越多的證據(jù)表明，自噬可以幫助腫瘤細胞分解大分子物質來提供能量，從而適應腫瘤細胞惡劣的微環(huán)境，從而有利于腫瘤細胞的存活[12]。失巢凋亡是指細胞與細胞外基質喪失接觸后誘導的凋亡。癌細胞可通過血管及淋巴系統(tǒng)轉移至遠處組織和器官，在此期間，自噬可使癌細胞在失去細胞外基質的情況下存活和增殖，避免失巢凋亡[13]。一項研究表明，在肺轉移模型中，抑制自噬不僅可以減少肝癌細胞的侵襲和遷移，而且還可以降低肝癌細胞抵抗失巢凋亡[14]。鉑類藥物為基礎的化療是喉癌治療中重要方式之一，化療耐藥的產生降低了化療療效。研究表明癌細胞通過上調保護性自噬使腫瘤對抗癌藥物產生抗藥性[15]，抑制自噬可以提高癌癥患者化療的效果。

總之，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、抗癌治療過程中，自噬起著至關重要的作用。p62是自噬重要調節(jié)因子，是解決抗癌治療耐藥、復發(fā)和轉移的潛在治療靶點，通過調控p62的表達為提高腫瘤治療提供了潛在治療策略。