陳永源，周伯榮，鐘廣宏，李曉瑩，高萬里，羅建華 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510700)

抗血小板治療是心腦血管病患者重要的治療方法。如今抗血小板藥物已在臨床上廣泛使用，如何評(píng)價(jià)抗血小板藥物的療效及個(gè)體化治療已逐漸成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)上的熱點(diǎn)問題。血小板的聚集功能是血栓形成的重要因素[1]。血小板的聚集功能是目前臨床實(shí)踐中判斷血小板功能活化程度的金標(biāo)準(zhǔn)。血小板集聚功能檢測(cè)有諸多方法，主要的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)方法有光學(xué)法、電阻抗法、流式細(xì)胞術(shù)等，其中流式細(xì)胞術(shù)是通過測(cè)定血小板血管擴(kuò)張劑刺激磷蛋白 (VASP ，Vasodilator-stimulated phospho-protein)磷酸化程度，計(jì)算出血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI，Platelet Response Index)。Montalescote等評(píng)價(jià)VASP是“ADP誘導(dǎo)的血小板P2Y12受體激活的最合理評(píng)價(jià)方法，是氯吡格雷藥物療效最具有特異性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)”[2]。PL-11多參數(shù)血小板功能分析儀是一種最新的檢測(cè)血小板集聚功能的儀器，它采用全血連續(xù)檢測(cè)法對(duì)血小板計(jì)數(shù)并檢測(cè)血小板聚集功能。本研究主要對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VASP的磷酸化程度與PL-11多參數(shù)血小板功能分析儀使用連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法在檢測(cè)血小板聚集功能方面的效果比較，評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)與連續(xù)血小板計(jì)數(shù)法在監(jiān)測(cè)血小板聚集功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取 2015年我院就診的缺血性卒中患者95例，其中男63 例(66.32%)，女32例(33.86%)，平均年齡(65.68 ±10.24)歲。本研究由我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組患者均要簽署知情同意書。缺血性卒中診斷符合按中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)2010 年版腦梗死(動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成)診斷標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)符合以下納入標(biāo)準(zhǔn):①近1年來未發(fā)生急性腦梗死且NIHSS 評(píng)分在23 分以下的患者；②年齡45～85歲之間；③近2周來未服用以下藥物：氯吡格雷、阿司匹林等抗血小板藥物及他汀類降血脂藥物；④血小板計(jì)數(shù)處于正常范圍的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期出現(xiàn)嚴(yán)重急性腦血管病的患者；②有嚴(yán)重肝病或慢性腎臟病的患者；③有房間隔缺損、房顫等心臟疾病的患者；④凝血功能障礙的病人或免疫系統(tǒng)疾病的患者；⑤近期有行手術(shù)的患者；⑥對(duì)氯吡格雷、阿司匹林、他汀類藥物不能耐受的患者；⑦近2周有服用質(zhì)子泵抑制劑的患者。

1.2儀器與試劑：流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，PGE1(前列腺素E1，法國(guó)BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，流式細(xì)胞儀試劑，法國(guó)BIOCYTEX公司)，ADP(二磷酸腺苷，PL-11試劑，江蘇英諾華公司)。PL-11 血小板功能分析儀(由南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司提供 ) 及相關(guān)配套試劑(ADP，濃度為 50 mmol/L)。

1.3方法：

1.3.1記錄資料：記錄入組患者的各項(xiàng)生命體征，抽取靜脈血測(cè)定血常規(guī)、凝血功能指標(biāo)、心肝腎功及電解質(zhì)等指標(biāo)。

1.3.2標(biāo)本采集：所有入組患者服用氯吡格雷75 mg/d，服用1個(gè)月后均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集入組者肘靜脈血 ：2管/人，用含3.8%枸櫞酸鈉真空采血管抽取，用于血小板VASP磷酸化檢測(cè)的靜脈血用含3.8%枸櫞酸鈉真空采血管抽取。標(biāo)本保存在37 ℃的恒溫箱，在2 h內(nèi)完成測(cè)驗(yàn),血小板VASP磷酸化檢測(cè)可48 h內(nèi)完成檢測(cè)；檢測(cè)前不能出現(xiàn)凝集。

1.3.3檢測(cè)方法

1.3.3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板 VASP的磷酸化:VASP是細(xì)胞內(nèi)的一種激動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白，參與血小板的聚集活化。在基礎(chǔ)狀態(tài)下VASP呈非磷酸化狀態(tài)，cAMP(環(huán)磷酸腺苷)可以通過相關(guān)反應(yīng)使VASP磷酸化；患者血樣本與試劑 PGE1(前列腺素E1)或PGE1+ADP( 前列腺素E1+二磷酸腺苷)一起溫浴，當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過透化作用后，一種特異性單克隆抗體(克隆16C2)可識(shí)別已經(jīng)磷酸化的VASP ，這種特異性單克隆抗體(克隆16C2)可經(jīng)過免疫熒光方法(非洗脫)被標(biāo)記，經(jīng)過這種間接免疫熒光方法，流式細(xì)胞儀可根據(jù)熒光的信號(hào)分析這兩種形式的磷酸化水平，評(píng)估每個(gè)血樣本的VASP被ADP 抑制的磷酸化活性，計(jì)算出血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)。檢測(cè)時(shí)加入PGE1或PGE1 +ADP，測(cè)試管的熒光信號(hào)后，使用校正過的熒光強(qiáng)度均值(MFIc)計(jì)算PRI值。血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)=[MFIc(PGE1)-MFIc(PGE1+ADP)]/MFIc(PGE1)×100%。PRI≥50%定義為血小板高反應(yīng)性[3-4]，即氯吡格雷低反應(yīng)性。

1.3.3.2PL-11多參數(shù)血小板多功能分析儀用連續(xù)計(jì)數(shù)檢測(cè)法原理(SPCM：Sequencing Platelet Counting Method)檢測(cè)血小板聚集功能：該儀器對(duì)加入ADP試劑前后患者血小板的數(shù)目進(jìn)行連續(xù)計(jì)數(shù)，通過對(duì)比加入ADP前與加入后血小板數(shù)量的變化和血小板下降的速率，來評(píng)估血小板聚集功能。血小板最大聚集率(MAR)的結(jié)果(%)=(原始血小板數(shù)-聚集后血小板數(shù))/原始血小板數(shù)×100%。根據(jù)英諾華公司提供的標(biāo)準(zhǔn)：最大血小板聚集率≥55% 為血小板高反應(yīng)性，即氯吡格雷低反應(yīng)性。

2 結(jié)果

2.1兩種方法結(jié)果的基本情況：PL-11血小板分析儀計(jì)算所得MAR最小值為6.30%，最大值為77.50%，平均(31.88±19.09)%，測(cè)得血小板高反應(yīng)性例數(shù)為13例(13.68)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的PRI最小值為7.00%，最大值為68.00%，平均值為(31.20±15.54)%，測(cè)得血小板高反應(yīng)性例數(shù)為11例(11.58%)。血小板分析儀所檢測(cè)的MAR范圍高于PRI，見圖1。

圖1 兩種檢測(cè)結(jié)果比較

2.2兩種方法的相關(guān)性分析：有效觀察值個(gè)數(shù)數(shù)值為95，兩種檢測(cè)方法結(jié)果經(jīng)相關(guān)性分析(r=0.898，P<0.001)，說明兩種檢測(cè)方法存在明顯相關(guān)，見圖2。

3 討論

缺血性腦卒中(ischemic stroke)的病死率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命，可造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]?？寡“逅幬锸欠乐稳毖阅X卒中的關(guān)鍵[6]。相關(guān)研究表明，氯吡格雷可有效地降低缺血性卒中患者主要不良心腦血管事件的發(fā)生概率[7]，但有一定數(shù)量的患者存在氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)，即氯吡格雷抑制血小板聚集功能的作用減弱，服用常規(guī)劑量氯吡格雷時(shí)，仍會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的心腦血管不良事件，從而影響了患者受益[8]。對(duì)CR的檢測(cè)，關(guān)鍵在于血小板聚集功能檢測(cè)。目前測(cè)定血小板聚集率的方法和儀器種類較多。國(guó)外曾有研究結(jié)果提示VASP是評(píng)價(jià)ADP誘導(dǎo)的血小板P2Y12受體激活的最合理方法，也是氯吡格雷藥物療效最具有特異性的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[2]。血小板血管擴(kuò)張劑刺激磷蛋白(VASP)是細(xì)胞內(nèi)的一種肌動(dòng)調(diào)節(jié)蛋白，VASP通過磷酸化狀態(tài)參與血小板的聚集活化。VASP磷酸化時(shí)，血小板活性受到抑制，VASP去磷酸化時(shí)，可促進(jìn)血小板活化。VASP的磷酸化靠cAMP(環(huán)磷酸腺苷)調(diào)節(jié)。當(dāng)ADP與血小板膜上P2Y12受體結(jié)合后，可使cAMP合成減少，導(dǎo)致VASP去磷酸化，繼而促進(jìn)血小板活化。而PGE1(前列腺素E1)可使cAMP合成增多，促進(jìn)VASP磷酸化，從而抑制血小板的激活。氯吡格雷經(jīng)體內(nèi)代謝后形成的活性物可作用在血小板膜上的P2Y12受體，特異性阻斷P2Y12受體與ADP結(jié)合，從而抑制血小板活化。而且氯吡格雷活性物對(duì)基礎(chǔ)的VASP磷酸化及PGE1刺激的VASP磷酸化無影響,但明顯降低ADP對(duì)PGE1刺激 VASP磷酸化的抑制作用[9]。流式細(xì)胞儀可根據(jù)熒光的信號(hào)分析加入PGE1與PGE1 +ADP這兩種形式的磷酸化水平，根據(jù)公式，計(jì)算出血小板反應(yīng)指數(shù)(PRI)。應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)VASP具有以下優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)靈敏度、特異度較高，穩(wěn)定性好,室溫下檢測(cè)前樣本可保存48 h，甚至高達(dá)72 h[10]。但其操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，難以應(yīng)用于臨床。PL-11血小板分析儀是運(yùn)用庫爾特原理的連續(xù)自動(dòng)計(jì)數(shù)檢測(cè)方法[11]，通過直接對(duì)血標(biāo)本中血小板數(shù)量在誘聚劑加入后的變化進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，直接反應(yīng)血小板聚集功能。作為新型檢測(cè)方法，具有成本低、操作簡(jiǎn)便易行、復(fù)測(cè)方便、自動(dòng)化、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。本研究分別通過流式細(xì)胞術(shù)VASP法和PL-11血小板分析儀檢測(cè)血小板聚集功能。結(jié)果表明，PL-11血小板分析儀檢測(cè)的結(jié)果與VASP法具有較好的相關(guān)性(r值=0.898)。研究提示兩種檢測(cè)方法的血小板聚集力分別為PL-11血小板分析儀的(31.88±19.09)%與流式細(xì)胞術(shù)VASP法的(31.20±15.54)%，使用流式細(xì)胞術(shù)VASP法的血小板聚集力的標(biāo)準(zhǔn)差較小，同時(shí)結(jié)合入組患者的血小板聚集率，考慮流式細(xì)胞術(shù)VASP法的穩(wěn)定性較高，受影響因素較少。

綜上所述，PL-11血小板分析儀與流式細(xì)胞術(shù)VASP法在檢測(cè)血小板聚集功能時(shí)有較好的相關(guān)性，可用于臨床或?qū)嶒?yàn)室使用的血小板功能檢測(cè)方法。