暢 鵬，謝艷英，王 浩，夏秀芳

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

鏡鯉魚具有高蛋白和高食用價值，已成為一種世界范圍廣泛養(yǎng)殖的淡水魚[1-2]，隨著海洋魚類資源的稀缺，鏡鯉魚已成為魚糜制品的原料。魚糜制品的加工主要利用蛋白的凝膠特性，蛋白質的聚集是形成凝膠的必要過程，熱誘導凝膠的形成是蛋白質發(fā)生熱聚集的最終結果，蛋白質熱聚集行為是凝膠形成的動態(tài)變化過程[3]。因此，蛋白質熱聚集行為的研究對了解蛋白凝膠特性至關重要。

蛋白熱聚集行為的發(fā)生與蛋白質結構變化關系密切。熱處理是蛋白質結構修飾的常用技術[4]，熱處理可以改變蛋白質的二級、三級和四級結構[5]，并使蛋白質結構發(fā)生轉化[6]。例如，熱處理可以使蛋白質的α-螺旋結構含量減少，β-折疊結構含量增加，實現(xiàn)蛋白結構的轉化。β-折疊結構含量與蛋白熱致凝膠強度呈正相關性[7]。因此，清楚了解熱處理條件對蛋白結構以及理化性質的影響對蛋白熱聚集行為的研究至關重要。目前，國內外已經對蛋白質熱聚集行為進行了一定的研究，并發(fā)現(xiàn)因蛋白質來源不同，蛋白質的變性溫度[8]、形成凝膠情況[9]、蛋白結構隨溫度變化情況[4]等都存在顯著差異（例如冷水魚蛋白變性溫度低于溫水魚[10]）。這表明熱處理條件對魚蛋白熱聚集行為的影響因物種的不同而不同。

目前，熱處理溫度及時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱聚集行為及其與凝膠特性相關性的研究還比較匱乏。因此，厘清熱處理溫度及時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱聚集行為的影響，可為進一步研究蛋白熱聚集行為對其凝膠特性的影響打下基礎，也可為如何選擇熱處理條件應用于鏡鯉魚魚糜制品加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活鏡鯉魚購買于哈爾濱市香坊區(qū)木材街集市。

1,4-哌嗪二乙磺酸（1,4-piperazinebis(ethanesulp honic acid)，PIPES）、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）、牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA） 上海遠業(yè)生物技術有限公司。所有其他試劑均為分析級或更高等級。

1.2 儀器與設備

FK-A(JJ-2)組織搗碎機 常州普天儀器制造有限公司；GL-21M冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；水浴鍋 上海赫田科學儀器有限公司；電子分析天平 賽多利斯（上海）貿易有限公司；TA.XT2質構分析儀 英國戈德爾明穩(wěn)定微系統(tǒng)有限公司；720G紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；ALPHA-T傅里葉變換紅外光譜儀 布魯克（北京）科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鏡鯉魚肌原纖維蛋白質的提取與處理

鮮活鏡鯉魚（1.5～2.5 kg）用鈍器擊暈、殺死并去除魚頭、鱗、內臟、皮，然后用清水洗凈，收集腹部和背部的白色肌肉，然后切碎。根據(jù)Sun Qinxiu等[11]的方法稍作修改，提取肌原纖維蛋白質。將切碎的魚肉（50～60 g）與4 倍體積的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L、pH 7.5）混合，然后用組織搗碎機勻漿1 min?；旌衔镉美鋬鲭x心機于5 000×g、4 ℃離心15 min，沉淀在相同的條件下用4 倍體積的磷酸鹽緩沖液提取兩次。然后在相同的條件下用4 倍體積的NaCl溶液（0.1 mol/L）洗滌沉淀兩次。最后，將沉淀與4 倍體積的NaCl溶液（0.1 mol/L）混勻。用4 層脫脂紗布過濾混合物兩次。過濾后，懸浮液在5 000×g、4 ℃下離心15 min，沉淀即為肌原纖維蛋白質，48 h內使用。所有工作均在4 ℃下進行。

以牛血清白蛋白為標準溶液，用雙縮脲法測定蛋白溶液的質量濃度。用1 mol/L HCl、NaOH、NaCl、PIPES配制pH 6.0、含有0.6 mol/L NaCl的15 mmol/L或50 mmol/L PIPES緩沖液。除40 mg/mL蛋白樣品用50 mmol/L PIPES緩沖液配制外，其他蛋白質量濃度樣品都用15 mmol/L PIPES緩沖液配制。配制的蛋白樣品在4 ℃、10 000 r/min下均質30 s。另外，40 mg/mL蛋白質樣品在4 ℃下手動攪拌。樣品按照熱處理溫度與時間的不同組合分組編號，然后將其置于相應設定溫度（30、40、50、60、70、80、90 ℃）的水浴鍋中進行加熱，當溫度達到設定溫度后進行0、15、30、45、60 min保溫處理，將剛達到設定熱處理溫度和時間的鏡鯉魚肌原纖維蛋白樣液迅速置于4 ℃的冷藏柜中備用。

1.3.2 肌原纖維蛋白溶解度測定

肌原纖維蛋白溶解度的測定按Li Fangfei等[12]的方法并稍作修改。取6 mL處理過的蛋白樣液（2 mg/mL），經10 000×g、4 ℃離心10 min，離心后上清液中蛋白質量濃度與離心前蛋白質量濃度的百分比即可表示為蛋白質溶解度。

1.3.3 肌原纖維蛋白濁度測定

肌原纖維蛋白濁度的測定按Xu Yanshun等[13]的方法并稍作修改。取處理過的0.5 mg/mL蛋白樣液，使用紫外-可見分光光度計測定350 nm波長下樣品的吸光度。用A350nm表示蛋白樣品的濁度。

1.3.4 肌原纖維蛋白表面疏水性測定

表面疏水性的測定根據(jù)Cherh等[14]的方法并稍加修改。將400 μL溴酚藍（1 mg/mL）添加到2 mL處理后的蛋白質樣品（5 mg/mL）中，混勻。然后，以7 000 r/min離心15 min，上清液用去離子水稀釋10 倍，在595 nm波長處測定吸光度（A595nm）。以15 mmol/L PIPES緩沖液作空白，處理與樣品操作相同。根據(jù)公式（1）計算表面疏水性。

式中：A1為空白樣的吸光度；A2為樣品的吸光度。

1.3.5 肌原纖維蛋白總巰基含量測定

肌原纖維蛋白總巰基含量的測定根據(jù)Lü Tong[15]和Xia Xiufang[16]等的方法并稍加修改。向1 mL蛋白樣液（2 mg/mL）中加入8 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、8 mol/L尿素、4 mmol/L EDTA，pH 8），混勻，10 000×g離心15 min。然后取4.5 mL上清液，加入0.5 mL DTNB（10 mmol/L），混勻，在室溫下放置30 min。使用720G可見分光光度計在412 nm波長處測定吸光度。以15 mmol/L PIPES緩沖液作空白。根據(jù)公式（2）計算總巰基含量。

式中：A為減去空白溶劑后在412 nm波長處的吸光度；N為稀釋因子（10）；ρ為蛋白質質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6 肌原纖維蛋白活性巰基含量測定

肌原纖維蛋白活性巰基含量的測定根據(jù)Xia Xiufang等[16]的方法并稍加修改。向1 mL蛋白樣液（2 mg/mL）中加入8 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L EDTA，pH 8），混勻，10 000×g離心15 min。然后取4.5 mL上清液，加入0.5 mL DTNB溶液（10 mmol/L），混勻，在室溫下放置30 min。用分光光度計測定樣品在412 nm和540 nm波長處的吸光度。根據(jù)公式（3）計算活性巰基含量。

式中：A412nm和A540nm分別為測定樣液在412 nm和540 nm的吸光度。

1.3.7 肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜分析

肌原纖維蛋白二級結構含量的測定按Zhang Yan[17]和Zhou Feibai[18]等的方法并稍加修改。將經處理的蛋白質樣品（40 mg/mL）在－20 ℃下冷凍10 h，置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥。凍干樣品用研缽研磨成粉末，經80 目過濾篩過濾備用。取樣品與KBr（1∶100，m/m）充分混合，并壓縮成片劑。以KBr片作為空白。樣品用傅里葉變換紅外光譜儀以4 cm－1的分辨率和64 次掃描模式分析。使用PeakFit 4.12軟件對酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）進行光譜分析。用峰面積比率來表示蛋白質二級結構的相對含量。

1.3.8 熱誘導凝膠破碎力測定

稱17 g 40 mg/mL蛋白樣于稱量瓶（30 mm×50 mm）中，將其放入水浴鍋中進行熱處理。將處理后的樣品置于4 ℃的冰箱中24 h，取出在室溫下放置30 min。參照Li Fangfei等[19]的方法并稍加修改，進行熱誘導凝膠質構分析。質構分析儀P/0.5的探針與稱量瓶的中心對齊，并在穿刺模式下測定。測前速率1 mm/s、測試速率2 mm/s、測后速率10 mm/s、測試距離10 mm、觸發(fā)力10 g。記錄測試峰值，即熱誘導凝膠的破碎力（N）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

除傅里葉變換紅外光譜外，其他每個實驗進行3 次平行。所得數(shù)據(jù)用Excel軟件整理，使用Statistix 8.0軟件的Tukey HSD程序進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。使用SigmaPlot 12.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白溶解度的影響

圖1 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of heating temperature and time on the solubility of myofibrillar proteins from mirror carp

由圖1可知，30～70 ℃升溫過程中蛋白溶解度顯著減?。≒＜0.05），70～90 ℃蛋白溶解度基本穩(wěn)定。當溫度一定時，隨著加熱時間的延長，蛋白溶解度呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。這可能是因為經加熱處理后的蛋白結構展開，內部疏水基團、巰基外漏，導致蛋白疏水性增加、二硫鍵形成，引起蛋白交聯(lián)聚集，溶解度降低[20]。30、40 ℃保溫處理時，在15 min之后蛋白溶解度基本保持穩(wěn)定，表明此時蛋白變性程度小。溫度從60 ℃升至到70 ℃時，蛋白溶解度發(fā)生急劇下降，這可能是因為肌球蛋白尾部結構變性延伸后形成更高聚合程度的聚集體；并且在70 ℃處理30 min時蛋白溶解度最低（1.8%）；高于70 ℃后隨著加熱時間的延長，蛋白溶解度基本保持穩(wěn)定；表明鏡鯉魚肌原纖維蛋白在70 ℃保溫處理時蛋白已基本變性，結構完全展開，并發(fā)生顯著的聚集。Li Chao等[21]研究加熱溫度對肌原纖維蛋白溶解度的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著加熱溫度的升高，蛋白質溶解度顯著降低。

2.2 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白濁度的影響

濁度作為監(jiān)測蛋白質聚集水平的重要指標，其增加表明蛋白質聚集體的形成[22]。如圖2所示，30～70 ℃升溫過程中蛋白濁度顯著增加（P＜0.05），70～90 ℃蛋白濁度基本穩(wěn)定。當溫度（30～70 ℃）一定時，隨著加熱時間的延長濁度顯著增加（P＜0.05）。這表明經熱處理的蛋白質分子發(fā)生變性，其易通過共價鍵或非共價鍵交聯(lián)聚集[23]。70 ℃處理30 min蛋白濁度最大（0.81），再經進一步加熱保溫處理濁度變化較小，其中90 ℃處理60 min的蛋白濁度有所減小，這可能是因為高溫長時加熱處理的蛋白質不穩(wěn)定，形成可溶聚集體或已形成的聚集體發(fā)生裂解。另外，溶解度的變化情況也對其進行了闡明。Vate[24]和Chen Xing[25]等分別發(fā)現(xiàn)沙丁魚蛋白和雞胸肉蛋白濁度隨著溫度的升高呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。

圖2 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白濁度的影響Fig.2 Effects of heating temperature and time on the turbidity of myofibrillar proteins from mirror carp

2.3 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性可以用來評估蛋白質物理化學狀態(tài)的變化[24]。不同熱處理條件對蛋白質表面疏水性的影響如圖3所示，30～70 ℃升溫過程中蛋白表面疏水性顯著增加（P＜0.05）；當溫度（30～60 ℃）一定時，隨著加熱時間的延長表面疏水性呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05）。說明經熱處理的蛋白質分子發(fā)生變性，結構展開，內部疏水基團外漏增加。溫度高于70 ℃后加熱保溫處理蛋白表面疏水性變化較小。這表明70 ℃時蛋白質結構展開已較完全。蛋白表面疏水性的增加表明蛋白質相互作用從親水性轉變?yōu)槭杷?，導致蛋白質聚集增加[26]。這一結果與濁度（圖2）和溶解度（圖1）的結果相一致，很好地說明了表面疏水性是蛋白質聚集體形成的作用力之一。Mitra等[27]研究了不同熱處理條件對豬肉蛋白表面疏水性的影響，發(fā)現(xiàn)經熱處理的豬肉蛋白表面疏水性顯著增加。

圖3 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Effects of heating temperature and time on the surface hydrophobicity of myofibrillar proteins from mirror carp

2.4 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

圖4 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白總巰基含量的影響Fig.4 Effects of heating temperature and time on the content of total sulfhydryl groups in myofibrillar proteins from mirror carp

圖4 顯示了不同熱處理條件下蛋白總巰基含量的變化情況。30、40 ℃處理蛋白總巰基含量無顯著差異（P＞0.05），這表明低溫條件下蛋白變性程度小，并不能誘導蛋白巰基的變化。40～90 ℃升溫過程中蛋白總巰基含量顯著減?。≒＜0.05）；當溫度一定時，隨著保溫時間的延長，總巰基含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05）[26]。表明溫度的升高導致蛋白質結構展開，內部巰基基團外漏，外漏的巰基基團易被氧化形成二硫鍵[28]。這一結果很好地解釋了濁度和溶解度的結果，并證明二硫鍵是引起蛋白質聚集體形成的主要作用力之一。Buamard等[28]研究加熱溫度對沙丁魚蛋白總巰基的影響發(fā)現(xiàn)，蛋白總巰基含量隨著加熱溫度的升高而降低。

2.5 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響

活性巰基的存在表明蛋白分子內或分子間易形成二硫鍵[29]。圖5顯示了不同熱處理條件下活性巰基含量的變化情況。30 ℃條件下，隨著保溫時間的延長，活性巰基含量先增加后趨于穩(wěn)定，表明30 ℃條件下蛋白已經開始發(fā)生變性，但不能誘導形成二硫鍵。40～90 ℃升溫過程中蛋白活性巰基含量顯著減?。≒＜0.05）；當溫度（40～90 ℃）一定時，隨著加熱時間的延長活性巰基含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢（P＜0.05）。表明溫度的升高利于蛋白分子內或間的巰基基團氧化形成二硫鍵，導致蛋白質之間發(fā)生交聯(lián)聚合[30]。

圖5 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白活性巰基含量的影響Fig.5 Effects of heating temperature and time on the content of reactive sulfhydryl groups in myofibrillar proteins from mirror carp

2.6 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白二級結構的影響

圖6 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白二級結構的影響Fig.6 Effects of heating temperature and time on the secondary structure of myofibrillar proteins from mirror carp

圖6顯示了不同熱處理條件下的傅里葉變換紅外光譜圖。酰胺I帶（1 600～1 700 cm－1）常被用于指示蛋白質二級結構的變化。該區(qū)域主要與多肽中N—H基團的平面內彎曲、C＝O基團的伸縮振動以及肽鍵中C—N的伸縮振動有關[31]。表1為從酰胺I帶獲得的蛋白質二級結構的定量分析結果。30～90 ℃升溫過程中蛋白β-折疊結構相對含量逐漸增加，α-螺旋結構相對含量逐漸減少；此外，當溫度恒定時，隨著保溫時間的延長，蛋白β-折疊和α-螺旋結構相對含量與升溫過程變化趨勢相同。這意味著熱處理誘導蛋白質變性、蛋白結構展開、蛋白二級結構轉化[31]。蛋白α-螺旋結構相對含量降低、β-折疊結構相對含量增加，則表明蛋白具有形成強凝膠強度和高保水性凝膠的能力[32]。另外，30～40 ℃熱處理過程蛋白質無規(guī)卷曲結構相對含量有所增加，這也表明蛋白質發(fā)生變性，結構展開。Liu Ru[7]、李鵬[33]等研究了豬肉、雞肉、魚肉蛋白結構與其凝膠特性的相關性，發(fā)現(xiàn)蛋白β-折疊結構相對含量的增加能夠提高蛋白質凝膠性，此研究結果與本研究結果相似。

表1 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白二級結構相對含量的影響Table 1 Effects of heating temperature and time on the secondary structure contents of myofibrillar proteins from mirror carp %

2.7 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱誘導凝膠破碎力的影響

破裂力是評判熱誘導凝膠強度的重要指標[34]。不同熱處理條件對鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱誘導凝膠破碎力的影響如圖7所示。30～70 ℃升溫過程中蛋白熱誘導凝膠破碎力顯著增加（P＜0.05），70～90 ℃升溫過程中蛋白熱誘導凝膠破碎力變化不顯著（P＞0.05）。另外，40、60 ℃保溫處理時，隨著加熱時間的延長熱誘導凝膠破碎力具有顯著增加趨勢（P＜0.05）；70、80 ℃保溫處理時，隨著加熱時間的延長熱誘導凝膠破碎力具有增加趨勢，但變化不顯著（P＞0.05）；其中70 ℃處理30 min的蛋白形成的熱誘導凝膠破碎力最大（1.07 N）。這是因為經熱處理后，變性的蛋白質分子之間通過疏水相互作用、二硫鍵、氫鍵等作用力相互交聯(lián)形成具有三維網(wǎng)狀結構的聚集體。所測定的蛋白表面疏水性、巰基含量、蛋白質二級結構結果很好地解釋了蛋白熱誘導凝膠破碎力的結果。然而，在高于70 ℃熱處理條件下蛋白熱誘導凝膠的破碎力反而有所減小，這可能是因為高溫引起蛋白之間聚集速率加快，失去蛋白變性速率和聚集速率的動態(tài)平衡，造成所形成的聚集體網(wǎng)絡結構較為無序，從而導致破碎力的減小。鄧麗[35]、姜啟興[36]等通過研究熱加工過程中鮑魚蛋白質、鳙魚蛋白質構特性的變化情況，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的增加鮑魚蛋白、鳙魚蛋白凝膠強度呈先增加后減小趨勢；其在80 ℃蛋白凝膠強度達到最大值，隨后因為溫度的升高導致蛋白凝膠劣化。

圖7 加熱溫度和時間對鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱誘導凝膠破碎力的影響Fig.7 Effects of heating temperature and time on the rupture power of heat-induced gels of myofibrillar proteins from mirror carp

3 結 論

熱處理使得鏡鯉魚肌原纖維蛋白結構發(fā)生變化，引起蛋白質之間發(fā)生聚集。30 ℃處理條件下，蛋白聚集程度小，其中表面疏水相互作用是維持蛋白質聚集的主要作用力，此時不形成二硫鍵。從40 ℃開始，隨著溫度的升高，蛋白變性程度增加，表面疏水相互作用增加，二硫鍵開始形成，并參與到蛋白質聚集體形成的過程中，從而引起蛋白溶解度降低、濁度增加、熱誘導凝膠破碎力增加。在溫度達到70 ℃之后蛋白熱聚集行為基本穩(wěn)定，70 ℃時已基本達到鏡鯉魚肌原纖維蛋白完全變性條件，并且在70 ℃處理30 min時蛋白凝膠強度最大（1.07 N）。在0～15 min保溫處理過程中蛋白各指標水平變化最為顯著（P＜0.05），并在30 min基本保持穩(wěn)定。另外，在90 ℃條件下加熱超過30 min后，蛋白熱誘導凝膠破碎力顯著降低（P＜0.05）。因此，在之后進一步研究鏡鯉魚肌原纖維蛋白熱聚集行為對其凝膠特性影響時，可以重點研究40、70 ℃加熱溫度和30 min內加熱時間條件下兩者的相關性。另外，在選擇熱處理條件應用于鏡鯉魚魚糜制品加工時，應避免使用高溫長時的熱處理方式。