鄒 穎，余元善，鄒 波，程麗娜，肖更生，吳繼軍，卜智斌，徐玉娟

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610）

桑果鮮果味道甜美多汁，含有人體所必需的營養(yǎng)素如維生素、氨基酸、礦物質(zhì)以及具有生理活性的黃酮類、酚酸類化合物，是1993年首批列入“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究確證桑果具有抗氧化、抗炎、增強機體免疫力、護肝、降血糖、降血脂等功能[2]。但桑果季節(jié)性強，且柔軟、含水量高，不易貯藏或運輸，極易腐爛，所以目前對桑果資源的利用主要是在原產(chǎn)地進(jìn)行加工，直接榨汁或者少部分用于釀造果酒、果醋，而產(chǎn)生的大量果渣則被白白丟棄，且桑葚渣中仍殘留大量花色苷、多酚和黃酮等活性成分[3-4]。桑葚渣多酚提取物中富含多酚類物質(zhì)，尤其是花色苷，是一種潛在的抗氧化物質(zhì)的來源。桑葚渣中的花色苷主要為矢車菊-3-蕓香糖苷和矢車菊-3-葡萄糖苷，是桑果主要的活性成分和呈色物質(zhì)[5-6]。但花色苷是一類高活性但易降解的黃酮類化合物，它們的穩(wěn)定性取決于環(huán)境和化學(xué)因素，如pH值、金屬離子、光照、紫外線照射、溫度、氧及酶活性等[7]。由于這些化合物在加工和貯存過程中穩(wěn)定性較差，特別是在水溶液的食品體系中[8]，因此，需通過有效的技術(shù)手段提高其穩(wěn)定性。微膠囊技術(shù)是以天然或人工合成的高分子成膜材料為壁材，以所保護的物質(zhì)為芯材并將其進(jìn)行包埋，通過微膠囊化可以減少芯材與外界環(huán)境接觸，使其免遭光照、溫度或氧氣等條件的破壞，從而提高芯材的穩(wěn)定性，延長目標(biāo)物質(zhì)的貨架壽命[9]。前人對不同原料來源的多酚類提取物的微膠囊化進(jìn)行了研究，如覆盆子[10]、可可殼[11]、黑米[12]、葡萄皮[13]等，均提高了其穩(wěn)定性。

本實驗以副產(chǎn)物桑葚渣為原料，制備了一種醇提物，添加凍干保護劑得到桑葚渣多酚提取物凍干粉，以期獲得穩(wěn)定的富含多酚化合物的功能型果粉配料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮桑葚渣由四川攀枝花桑果汁工廠提供；2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH）、熒光素、Trolox（純度99%）、原兒茶酸、蘆丁、槲皮素、金絲桃苷 美國Sigma公司；麥芽糊精 河南萬邦實業(yè)有限公司；乳清蛋白粉 河北千聚生物科技有限公司。實驗所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash型酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；UV-721型紫外-可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器儀表有限公司；LRH-250A-II生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器 江蘇蘇昆儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚渣多酚提取液的制備

取新鮮桑葚渣加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%檸檬酸為酸化劑），超聲提取3 次，每次20 min，料液比1∶10，1 500×g離心10 min取上清液，合并3 次提取的上清液，45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至固形物含量為11 °Brix左右，－20 ℃保藏備用。

1.3.2 桑葚渣多酚提取物凍干粉的制備

分別按一定比例向桑葚渣多酚提取濃縮液中添加凍干保護劑（麥芽糊精、乳清蛋白、發(fā)酵荔枝果渣），攪拌均勻后放置在4 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷1 h，隨后置于－80 ℃下冷凍30 min，最后放入真空冷凍干燥機中干燥48 h，其冷肼溫度為－80 ℃，真空度小于10 MPa，得到各桑葚渣多酚提取物凍干粉。P1為未添加保護劑，P2為提取物干物質(zhì)（dry extract，DE）-麥芽糊精-乳清蛋白質(zhì)量比1∶1∶1，P3為DE-乳清蛋白質(zhì)量比1∶2，P4為DE-麥芽糊精質(zhì)量比1∶2，P5為DE-發(fā)酵荔枝果渣質(zhì)量比1∶1，P6為DE-乳清蛋白質(zhì)量比1∶4，P7為DE-麥芽糊精質(zhì)量比1∶4。

1.3.3 桑葚渣多酚提取物凍干粉總酚含量的測定

樣品提取液的制備方法參考Chen Qinqin等[14]的方法并作調(diào)整。取適量桑葚渣多酚提取物凍干粉，取2 g樣品，加入10 mL含體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸的甲醇，超聲提取10 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液，沉淀再用10 mL含體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸的甲醇超聲提取10 min，離心，與上述上清液合并，加含體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸的甲醇至30 mL，混勻?？偡雍康臏y定參考Folin-Ciocalteu法[15]進(jìn)行。

依據(jù)國家防總制定的有關(guān)辦法和四部委相關(guān)文件精神，結(jié)合江西省實際，特別是后期項目運行管理的要求，制定 《江西省山洪災(zāi)害防治縣級非工程措施項目建設(shè)管理辦法》和《江西省山洪災(zāi)害防治縣級非工程措施項目驗收管理辦法》，用于指導(dǎo)項目實施和明確各級各部門的建設(shè)職責(zé)。

1.3.4 桑葚渣多酚提取物凍干粉總花色苷含量的測定

總花色苷含量參照Giusti等[16]的方法，采用pH示差法測定。取2 g樣品，加入10 mL 1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的鹽酸-甲醇，超聲提取10 min，4 500 r/min離心5 min，取上清液，沉淀再用10 mL 1%的鹽酸-甲醇超聲提取10 min，離心后與上述上清液合并，加1%的鹽酸-甲醇至30 mL，混勻。取提取液2 份，分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖液，避光放置15 min，測定510 nm和700 nm波長處的吸光度?？偦ㄉ召|(zhì)量濃度按下式計算。

式中：A＝（A510nm，pH1.0－A700nm，pH1.0）－（A510nm，pH4.5－A700nm，pH4.5）；M為矢車菊素-3-葡萄糖的摩爾質(zhì)量（449.2 g/mol）；ε為26 900 L/（mol·cm）；1為比色皿光徑（1 cm）。

1.3.5 桑葚渣多酚提取物凍干粉氧自由基吸收能力的測定

參考Steed等[17]的方法，樣品用pH 7.4的75 mmol/L磷酸鹽緩沖液稀釋后備用。黑色96 孔板每孔加入20 μL稀釋后的樣品，孵育至37 ℃，加入80 μL 1.25 μmol/L熒光素鈉溶液（磷酸鹽緩沖液配制），37 ℃孵育5 min，每孔加入100 μL 140 mmol/L的AAPH，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀測各孔的熒光強度。以120 μL蒸餾水與80 μL 1.25 μmol/L的熒光素鈉溶液混合作為陰性對照，以20 μL蒸餾水與80 μL 1.25 μmol/L的熒光素鈉溶液以及100 μL的140 mmol/L AAPH為空白對照。分別移取500 μmol/L Trolox 4、8、12、16、20 μL于96 孔板后，加蒸餾水至20 μL作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

熒光強度測定條件：激發(fā)波長485 nm；發(fā)射波長520 nm，循環(huán)35 次，每個循環(huán)2.5 min。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）以Trolox當(dāng)量表示，單位μmol/g。以O(shè)RAC表征抗氧化活性。

1.3.6 桑葚渣多酚提取物凍干粉的單體酚類物質(zhì)含量的測定

單體酚類物質(zhì)含量參考曾丹等[18]的方法，采用高效液相色譜法測定。色譜柱：Wondasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為體積分?jǐn)?shù)4%的磷酸溶液，流動相B為乙腈。梯度洗脫程序如下：0～10 min，8% B；10～55 min，8%～18% B；55～55.01 min，18%～70% B；55.01～60 min，70% B；60～60.01 min，70%～8% B；60.01～66 min，8% B；每個樣品之間平衡1 0 m i n，進(jìn)樣量1 0 μ L，流速1 mL/min，檢測波長520 nm，柱溫35 ℃。外標(biāo)法定量分析單個花色苷的含量，稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解，然后配制成混合標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋至不同質(zhì)量濃度，進(jìn)行高效液相色譜分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍為2.5～100 mg/L。

參考林戀竹等[19]的方法并略作修改，配制10 mg/mL樣品溶液，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0，加入樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胃蛋白酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h；用0.1 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)至pH 5.3，接著用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5，加入樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的胰酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h。每隔1 h取樣，沸水浴中滅活，冷卻，6 000×g離心15 min，取上清液，測定總花色苷含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件中的方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗，以P＜0.05為差異顯著，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚、總花色苷含量及抗氧化活性

桑葚渣多酚提取物中富含多酚類物質(zhì)，尤其是花色苷，是一種潛在的抗氧化物質(zhì)來源。本研究以副產(chǎn)物桑葚渣為原料，制備了一種醇提物，并對添加不同的凍干保護劑（麥芽糊精、乳清蛋白、荔枝發(fā)酵果渣）所得桑葚渣多酚提取物凍干粉進(jìn)行了分析，以期獲得穩(wěn)定的富含多酚化合物的成分，用于功能性食品或食品補充劑的生產(chǎn)。

表1 桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚、總花色苷含量及抗氧化活性Table 1 Contents of total polyphenols and total anthocyanins, and antioxidant activity of freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry pomace

如表1所示，添加不同的凍干保護劑后的桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚含量均有所提高（單獨添加麥芽糊精組除外），其中P6組最高（93.42 mg/g），P5次之（89.72 mg/g）；總花色苷含量由高到低依次為：P5＞P7＞P3＞P1＞P4＞P6＞P2，以P5含量最高（16.39 mg/g），顯著高于P1未添加保護劑組；P2、P6組的總花色苷含量與P1未添加保護劑組相比有所下降，可能是由于包埋影響了花色苷的提取率，類似的結(jié)果在Papillo等[12]的研究中也有報道。添加不同的凍干保護劑后的桑葚渣多酚提取物凍干粉的抗氧化活性均有顯著提高。

2.2 桑葚渣多酚提取物凍干粉的單體酚類物質(zhì)含量

矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷是桑葚渣多酚提取物凍干粉中主要的花色苷單體，Song Wei[20]、李豐廷[21]等在對桑葚的研究中均得出相似結(jié)論。添加不同凍干保護劑的桑葚渣多酚提取物凍干粉的單體花色苷含量均顯著降低，保護劑的包裹影響了花色苷的提取率，可能是提取過程中離心后沉淀中還有少數(shù)與輔料結(jié)合的花色苷殘留。桑葚渣多酚提取物凍干粉的高效液相色譜分析結(jié)果如圖1所示。

圖1 桑葚渣多酚提取物凍干粉高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography gram of freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry pomace

表2 桑葚渣多酚提取物凍干粉的單體酚類物質(zhì)含量Table 2 Contents of major phenolic compounds in freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry pomace

由表2可知，P1未添加保護劑組中矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為（15.87±0.25）mg/g，矢車菊素-3-蕓香糖苷含量為（4.96±0.08）mg/g，P5矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為（14.82±0.14）mg/g，矢車菊素-3-蕓香糖苷含量為（4.68±0.03）mg/g；蘆丁是桑葚渣多酚提取物凍干粉中含量最豐富的單體酚類物質(zhì)，含量為（1 440.35±4.09）～（1 978.20±3.43）μg/g，在桑葚渣多酚提取物凍干粉中還鑒定出了原兒茶酸、槲皮素、金絲桃苷，原兒茶酸的含量為（83.19±1.41）～（128.52±1.43）μg/g，金絲桃苷的含量為（141.82±1.49）～（190.40±4.06）μg/g，槲皮素的含量為（2.73±0.08）～（48.49±0.98）μg/g。在Papillo等[12]的研究中微膠囊組的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量也僅為未包埋組的88.9%～96.3%，在一定程度上說明了包埋會影響提取率，測出的數(shù)值呈偏低的趨勢?？傮w而言，P5的包埋效果較好，其次為P4、P7（麥芽糊精包埋組）。

2.3 桑葚渣多酚提取物凍干粉貯藏過程中的穩(wěn)定性

表3 25 ℃貯藏1 個月桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚、總花色苷含量及抗氧化活性Table 3 Contents of total polyphenols and total anthocyanins, and antioxidant activity of freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry residues after storage at 25 ℃ for one month

為了對桑葚渣多酚提取物凍干粉的穩(wěn)定性進(jìn)行評價，測定了桑葚渣多酚提取物凍干粉在25 ℃貯藏1 個月后的總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性以及單體酚類物質(zhì)的含量。結(jié)合表1、3可知，P1未添加保護劑組的總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性分別下降了19.27%、18.16%、11.41%。對比之下，添加保護劑組均體現(xiàn)了一定的保護作用，且添加保護劑組的桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性總體顯著高于P1未添加保護劑組，但P5發(fā)酵荔枝果渣保護組的總花色苷含量（貯藏后降低39.9%）及抗氧化活性（貯藏后降低26.47%）較貯藏前明顯下降。說明麥芽糊精和乳清蛋白粉的添加提高了桑葚渣多酚提取物的貯藏穩(wěn)定性，且活性成分含量更高，抗氧化活性更強。麥芽糊精因其較好的水溶性和低黏性，可提高被包埋活性成分的氧化穩(wěn)定性[22]，有研究表明乳清蛋白對桑葚花青素具有較好的包裹性和輔色性，且兩者之間的緊密結(jié)合能力是其輔色效果顯著的原因[23]。但P5發(fā)酵荔枝果渣組貯藏過程并未體現(xiàn)出明顯的保護效果，可能是輔料添加比例較少，25 ℃貯藏1 個月后吸潮嚴(yán)重。

從單體酚類物質(zhì)的含量來看（表2、4），貯藏后P1未添加保護劑組的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為（11.63±0.13）mg/g，矢車菊素-3-蕓香糖苷含量為（4.14±0.05）mg/g，分別下降26.72%、16.53%，相較而言，P4、P7的2 種主要花色苷單體的含量25 ℃貯藏1 個月后沒有明顯下降，體現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性。

表4 25 ℃貯藏1 個月桑葚渣多酚提取物凍干粉的單體酚類物質(zhì)含量Table 4 Contents of major phenolic compounds in freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry pomace after storage at 25 ℃ for one month

2.4 模擬胃、腸道消化對桑葚渣多酚提取物凍干粉總花色苷含量的影響

機體攝入的生物活性物質(zhì)在胃腸道消化過程中會發(fā)生降解或轉(zhuǎn)化。因此，攝入的活性物質(zhì)并不能完全被機體利用。研究表明，生物活性物質(zhì)對機體功效的主要影響因素為生物有效性即消化穩(wěn)定性[24]?？梢姡捎媚M體外消化的方法研究物質(zhì)的生物活性更接近于物質(zhì)被生物體利用的情況。生物可接受度是營養(yǎng)物可被機體吸收利用的程度，即營養(yǎng)物直接進(jìn)入人體的消化系統(tǒng)并可被人體胃、腸道溶解的部分，是評價營養(yǎng)有效性的一個關(guān)鍵指標(biāo)[25-27]。

圖2 模擬胃腸道消化對桑葚渣多酚提取物凍干粉總花色苷含量的影響Fig.2 Effect of simulated gastrointestinal digestion on the content of total anthocyanins in freeze-dried powder of polyphenol extracts from mulberry pomace

由圖2可知，未消化的P1未添加保護劑組的花色苷含量為15.52 mg/g。胃消化初期，花色苷含量逐漸降低，胃消化1、2 h后樣品的花色苷含量無明顯差異。腸消化階段，花色苷含量明顯下降。腸消化2 h后P1的花色苷含量下降了52.23%。隨著體外消化的進(jìn)行，微膠囊包埋組的花色苷含量亦呈明顯下降的趨勢，但P3、P6、P2經(jīng)腸消化2 h后花色苷含量分別比未消化時下降了28.13%、34.63%、40.54%，保留率均明顯高于P1未添加保護劑組。實驗結(jié)果表明，花色苷在胃消化條件下比腸消化條件下穩(wěn)定；隨著體外消化的進(jìn)行，樣品花色苷含量呈下降趨勢，這與Huang Haizhi[28]和Tagliazucchi[29]等的研究結(jié)果相似。此外，腸消化條件下花色苷含量顯著降低的原因可能是花色苷在中性條件下不穩(wěn)定，較容易降解為查耳酮或其他小分子酚類化合物[30]。且微膠囊包埋組（P3、P6、P2）中花色苷保留率較高，可能是因花色苷被壁材（乳清蛋白粉、麥芽糊精）包裹，避免其與環(huán)境直接接觸，說明將桑葚渣多酚提取物微膠囊化可提高其消化穩(wěn)定性。

3 結(jié) 論

添加不同的凍干保護劑后的桑葚渣多酚提取物凍干粉的總酚含量（單獨添加麥芽糊精組除外）及抗氧化活性均有所提高，但單體花色苷含量（表觀）均顯著降低，保護劑的包裹影響了花色苷的提取率，提取過程中離心后沉淀中還有少數(shù)與輔料結(jié)合的花色苷殘留，總體而言，P5的保護效果較好，其次為P4、P7（麥芽糊精包埋組）。

25 ℃貯藏1 個月后未添加保護劑組的桑葚渣多酚提取物凍干粉總酚含量、總花色苷含量、抗氧化活性分別下降了19.27%、18.16%、11.41%。微膠囊組均體現(xiàn)出一定的保護作用，麥芽糊精和乳清蛋白粉提高了桑葚渣多酚提取物的貯藏穩(wěn)定性，且活性成分含量更高，抗氧化活性更強。從單體酚類物質(zhì)的含量來看，P1未添加保護劑組的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量為（11.63±0.13）mg/g，矢車菊素-3-蕓香糖苷含量為（4.14±0.05）mg/g，分別下降26.72%、16.53%，相較而言，P4、P7的2 種主要的花色苷單體的含量25 ℃貯藏1 個月后沒有明顯下降，體現(xiàn)了較好的穩(wěn)定性。

桑葚渣多酚提取物凍干粉的花色苷在胃消化條件下比腸消化條件下穩(wěn)定；隨著體外消化的進(jìn)行，樣品花色苷含量呈下降趨勢，且微膠囊包埋組（P3、P6、P2）中花色苷保留率較高，提高了桑葚渣多酚提取物的消化穩(wěn)定性。