黃小蘭，何旭峰，楊 勤*，谷文超，周祥德，張 華，周 濃,*

（1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404100；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404100）

地參為唇形科地筍屬植物毛葉地筍（Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel）的干燥根莖，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品，可炒食、油炸、做醬菜等，堪稱蔬菜珍品[1]。地參野生資源廣泛分布于我國大部分地區(qū)，人工栽培于云南、山東、廣西、江蘇、江西、重慶、浙江等?。ㄊ校2]。目前有關(guān)地參的文獻報道主要集中在酚酸類[3-4]和多糖類[5]，研究表明，地參酚酸和多糖具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[6-7]。因此，地參備受人們關(guān)注，成為近年來保健食品、藥品等領(lǐng)域研究開發(fā)與應(yīng)用的熱點。但地參除含有酚酸、多糖、萜類與甾體、黃酮類、揮發(fā)油、微量元素、粗蛋白外[8-10]，還含有豐富的氨基酸類化合物[11-12]。

氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單元和人體的必需營養(yǎng)成分，不僅能判斷食品的營養(yǎng)狀況，而且作為食品加工或中藥炮制過程中參與美拉德反應(yīng)的底物之一，同樣也關(guān)聯(lián)和影響著食品的風(fēng)味和藥物的生理活性[13-14]。早期的研究表明地參中含有豐富的氨基酸成分，總含量可達2.72%，但研究停留在對云南產(chǎn)野生地參的粗略統(tǒng)計[11-12]，尚鮮見其深入的研究報道。因此，測定地參中氨基酸含量對地參的質(zhì)量控制、開發(fā)利用具有重要意義。

近幾年來，較為普遍的氨基酸測定方法有氨基酸分析儀法[15-17]、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法[18-19]、高效液相色譜法[20-21]，前2 種方法成本較高，普及度不高，高效液相色譜法操作簡單，成本較低，應(yīng)用范圍廣，常用于實驗室常規(guī)檢測。由于氨基酸的分子質(zhì)量較小，極性較強，沒有發(fā)色基團[22]，不利于直接檢測，雖有報道采用液相色譜-帶電氣溶膠檢測器直接測定氨基酸的含量[23]，但該法靈敏度低、重現(xiàn)性差，故通過衍生試劑給氨基酸添加發(fā)色基團更有利于檢測。目前常用的柱前衍生方法有異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）法、6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺活化環(huán)氨基甲酸酯（6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate，AQC）法[24]、鄰苯二醛（o-phthalaldehyde，OPA）法[25]、2,4-二硝基氟苯（2,4-dinitrofluorobenzene，F(xiàn)DNB）法[26]等。但AQC價格昂貴，OPA只能與一級氨基酸發(fā)生反應(yīng)且衍生物質(zhì)不穩(wěn)定，F(xiàn)DNB法需要在避光條件下進行且毒性較大[27-28]，而PITC可與一、二級氨基酸同時反應(yīng)，且價格便宜、操作簡單、衍生產(chǎn)物單一、穩(wěn)定，成為柱前衍生化測定氨基酸的首選。

本研究采用PITC對地參氨基酸進行柱前衍生化，即在堿性條件下，氨基酸與PITC相結(jié)合生成具有紫外吸收的化合物[29]，利用高靈敏度的超高效液相色譜（ultrahigh performance liquid chromatography，UPLC）儀進行分離檢測，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）、聚類分析對不同產(chǎn)地地參樣品進行差異分析，以期為地參在食品、保健食品以及藥品的深入開發(fā)利用方面提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參自采或委托采集于云南騰沖（S1）、重慶萬州（S2）、江蘇徐州（S3）、山東菏澤（S4）、廣西玉林（S5）、云南大理（S6）6 個地參主要栽培基地，重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院鑒定為唇形科地筍屬植物毛葉地筍的干燥根莖。

天冬氨酸 成都德思特生物技術(shù)有限公司；16 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 合肥博美生物科技有限公司；氨基酸信息詳見表1。

表1 17 種氨基酸信息Table 1 Information about 17 amino acids tested in this study

鹽酸、三乙胺、苯酚、乙酸鈉、冰醋酸（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠；PITC（純度≥99%，蛋白測序級） 上海麥克林生化科技有限公司；乙腈（色譜純） 德國默克公司；實驗用水為去離子超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class UPLC儀（配有二極管陣列檢測器和Empower色譜工作站） 美國Waters公司；Milli-Q Advantage A10超純水機（電阻率≥18.2 MΩ·cm）美國Millipore公司；3-30KS型高速離心機 德國Sigma公司；MS3型渦旋混合器 德國IKA公司；SQP萬分之一電子天平 德國Sartorius公司；TurboVap LV氮吹儀瑞典Biotage公司；BPG-9240A精密鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別稱取17 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用0.1 mol/L HCl溶液溶解，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，詳見表1。分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量于6 個10 mL量瓶中，用0.1 mol/L HCl溶液定容至刻度，得不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待衍生化操作。

1.3.2 樣品溶液的制備

1.3.2.1 地參樣品的水解

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定方法》[30]，將地參樣品經(jīng)50 ℃干燥，粉碎過35 目篩，備用。準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）地參粉末于頂空瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液10 mL，繼續(xù)向頂空瓶內(nèi)加入苯酚3 滴，立即密封。將頂空瓶置于110 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解22 h后，取出，冷卻至室溫，濾過，用少量純水多次沖洗殘渣并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加純水定容至刻度，混勻。取地參水解液0.4 mL于氮吹管中，在50 ℃水浴條件下氮吹至近干，加入0.4 mL純水復(fù)溶備用。

1.3.2.2 氨基酸衍生化

精密移取1.3.2.1節(jié)復(fù)溶后的水解液0.4 mL于10 mL離心管中，分別加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液和0.1 mol/L PITC-乙腈溶液各0.2 mL，混勻，室溫靜置60 min后，加入正己烷1 mL，渦旋混合器振蕩1 min，8 000 r/min冷凍離心5 min，萃取反應(yīng)過剩的PITC，棄上層正己烷，將下層溶液用純水定容至2 mL量瓶中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.3.3 空白溶液的制備

取0.1 mol/L鹽酸溶液0.4 mL于10 mL離心管中，自“分別加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液和0.1 mol/L PITC-乙腈溶液各0.2 mL”起照1.3.2.2節(jié)方法進行衍生化處理，即得。

1.3.4 色譜條件

A C Q U I T Y U P L C B E H C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）；檢測波長254 nm；柱溫40 ℃；進樣量1 μL；流速0.2 mL/min；流動相：A為0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈（97∶3，V/V）溶液（冰醋酸調(diào)pH 6.5），B為80%乙腈溶液；梯度洗脫：0～1 min，94% A，6% B；1～15 min，94%～65% A，6%～3 5% B；1 5 ～2 2 m i n，6 5%～4 0% A，35%～60% B。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對測定數(shù)據(jù)進行處理，氨基酸含量以表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行PCA和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生試劑用量的優(yōu)化

氨基酸的衍生反應(yīng)屬于競爭性反應(yīng)，只有足夠的衍生試劑才能保證所有氨基酸充分衍生化。本研究取最高濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4 mL，加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液0.2 mL，渦旋混勻，分別加入衍生試劑0.1 mol/L PITC-乙腈溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL進行衍生化反應(yīng)，通過各氨基酸衍生產(chǎn)物的峰面積確定最佳用量。結(jié)果表明：當(dāng)衍生試劑超過0.2 mL時，峰面積增幅不明顯，考慮到過量的PITC會造成色譜柱的損壞[26]，故本研究選擇衍生試劑用量為0.2 mL。

2.2 水解液酸堿度調(diào)節(jié)

氨基酸需在堿性條件下（約為pH 9）與PITC發(fā)生反應(yīng)生成具有紫外吸收的氨基酸衍生物[26]，故地參水解液pH值的調(diào)節(jié)尤為重要。本研究比較用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性和氮吹法除掉HCl溶液2 種方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值的過程中生成了大量的NaCl，當(dāng)加入三乙胺-乙腈溶液和PITC-乙腈溶液后，出現(xiàn)分層現(xiàn)象，衍生試劑與目標(biāo)物無法充分接觸，造成反應(yīng)不完全。而采用氮吹法除HCl溶液能完全避免這種現(xiàn)象，保證氨基酸完全衍生。在上述優(yōu)化后的條件下對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進行衍生化處理，按1.3.4節(jié)色譜條件注入UPLC儀進行測定，如圖1所示，各色譜峰峰形尖銳，分離度良好。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（A）與地參樣品（B）UPLC圖Fig. 1 UPLC chromatograms of mixture of 17 amino acid standards (A) and amino acids in hydrolysate of L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel (B)

2.3 線性關(guān)系、檢出限結(jié)果

表2 17 種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限、儀器精密度和方法重復(fù)性Table 2 Calibration curves, linear ranges, correlation coefficients,limits of detection, limits of quantitation, instrumental precision and method repeatability for amino acids detected by UPLC

取1.3.1節(jié)的17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.2.2節(jié)方法進行衍生化處理，以1.3.4節(jié)色譜條件依次進樣分析，記錄色譜峰峰面積，以各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積（Y）與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)信噪比計算檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。如表2所示，17 種氨基酸的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，表明線性關(guān)系良好；檢出限為0.020～0.110 μg/mL，定量限為0.067～0.368 μg/mL，表明儀器靈敏度高，可檢測較低質(zhì)量濃度的氨基酸。

2.4 儀器精密度結(jié)果

取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生化溶液按照1.3.4節(jié)色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄17 種氨基酸峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），見表2。結(jié)果顯示：各氨基酸峰面積的RSD在0.11%～2.32%之間，均小于3.00%，表明儀器精密度良好，可進行樣品分析。

2.5 方法重復(fù)性結(jié)果

精密稱取樣品（S6）0.5 g，平行6 份，按照1.3.2節(jié)制備樣品溶液，并按1.3.4節(jié)色譜條件進樣測定，記錄17 種氨基酸峰面積并計算RSD，見表2。結(jié)果顯示：各物質(zhì)峰面積RSD在0.27%～2.25%之間，表明該方法的重復(fù)性良好，可用于地參樣品中氨基酸的含量測定。

2.6 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性結(jié)果

取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生化溶液，分別在0、2、8、14、20、24、28、32、36 h時間里按照1.3.4節(jié)色譜條件進樣，結(jié)果顯示：各衍生產(chǎn)物隨著時間的延長，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度呈下降趨勢，在32 h內(nèi)測得17 種氨基酸RSD在0.30%～2.63%之間，均小于3.00%；超過32 h后，部分氨基酸RSD超過3.00%。表明氨基酸衍生產(chǎn)物隨著時間的推移發(fā)生了降解，為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，衍生化處理完畢后保證在32 h內(nèi)完成檢測。

2.7 加標(biāo)回收實驗結(jié)果

表3 17 種氨基酸回收率結(jié)果（n=6）Table 3 Recoveries of 17 amino acids spiked into sample (n= 6)

根據(jù)本實驗方法，稱取已測得氨基酸含量的地參樣品（S6）0.25 g各6 份，置于頂空瓶中，分別加入各標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，按照1.3.2節(jié)方法制備衍生化溶液，按1.3.4節(jié)色譜條件測定峰面積，計算回收率和RSD，以平均值表示，結(jié)果見表3。結(jié)果表明17 種氨基酸平均回收率為89.69%～106.02%，RSD為0.44%～2.60%，可以滿足地參中17 種氨基酸含量測定的要求。

2.8 地參樣品中氨基酸的含量測定

表4 不同產(chǎn)地地參中氨基酸含量（n=3）Table 4 Amino acid composition of samples collected from six differenthabitats (n= 3)mg/g

表5 地參氨基酸的物質(zhì)的量比（n=3）Table 5 Molar ration of amino acid (n = 3)

取6 個不同產(chǎn)地地參樣品按照1.3.2節(jié)進行樣品溶液的制備，平行3 份，注入UPLC測定氨基酸含量，并計算各氨基酸組分間物質(zhì)的量比，結(jié)果見表4、5。不同產(chǎn)地的地參酸水解液中均檢出17 種氨基酸，但氨基酸總量存在差異，介于19.463～81.663 mg/g之間，氨基酸總量為山東菏澤＞江蘇徐州＞云南騰沖＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州，平均含量為50.679 mg/g，明顯高于紫蘇葉與紫蘇子[29]、霍山石斛[14]、橄欖[18]，與黨參[31]含量接近。地參所含氨基酸中含量最高的為天冬氨酸，為6.268～18.450 mg/g，平均含量為13.338 mg/g，其次是谷氨酸，含量為3.088～13.346 mg/g，平均含量為8.478 mg/g，分別占總氨基酸含量的26.32%和16.73%，這與前期對云南地產(chǎn)野生地參的研究[11-12]結(jié)果一致；含量較低的氨基酸為甲硫氨酸和半胱氨酸，甲硫氨酸含量為0.109～0.514 mg/g，平均含量為0.316 mg/g，半胱氨酸含量為0.306～0.572 mg/g，平均含量為0.431 mg/g。

從表4可知，6 個產(chǎn)地地參中包括7 種人體必需氨基酸，含量為5.298～23.831 mg/g，平均含量為13.956 mg/g。必需氨基酸含量從高到低依次為纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸，含量最高的纈氨酸占氨基酸總量的5.36%，甲硫氨酸含量最低，占總量的0.62%。6 個產(chǎn)地地參按必需氨基酸含量排序為山東菏澤＞云南騰沖＞江蘇徐州＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州。不同產(chǎn)地地參必需氨基酸與氨基酸總量的百分比為23.99%～29.36%，平均值為27.35%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量的百分比為31.57%～41.57%，平均值為37.73%，與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)中對氨基酸理想模式的規(guī)定必需氨基酸與氨基酸總量比值為40%和必需氨基酸與非必需氨基酸比值為60%[32]有一定差距，表現(xiàn)為地參營養(yǎng)價值不夠均衡。

藥用氨基酸種類齊全，包括甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和精氨酸9 種，含量為13.887～55.890 mg/g，平均含量為35.825 mg/g，占總氨基酸的比例為68.44%～74.16%，平均比值為70.96%，高于枸杞[33]、石斛[34]等中藥，與黨參[31]含量相當(dāng)。結(jié)果顯示，盡管不同產(chǎn)地地參的藥用氨基酸含量相差較大，但其在總氨基酸中所占比例無明顯差異，與王曉媛等[34]對不同品種石斛的研究結(jié)果類似。其中天冬氨酸和谷氨酸作為地參中主要的藥用氨基酸，分別占藥用氨基酸總量的37.23%和23.67%，而谷氨酸和天冬氨酸作為對映體，在人體的氨基酸蛋白質(zhì)代謝過程中具有重要的作用[35]。研究表明，谷氨酸作為中樞神經(jīng)中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)可介導(dǎo)神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能改善學(xué)習(xí)和記憶能力[36]；同時谷氨酸被人體吸收后與血氨結(jié)合可解氨毒，具有保肝護肝的作用[37]。而天冬氨酸具有增強機體免疫力、消除疲勞、促進肝功能和保護心肌等生物活性，廣泛用于食品、保健食品、化妝品及工業(yè)原料中，需求量大[38]。在地參中精氨酸含量僅次于天冬氨酸、谷氨酸，達3.199 mg/g，有增強機體免疫功能、改善心腦血管等作用[31]。綜上所述，地參中富含各類藥用氨基酸為其開發(fā)成各種保健食品、藥品以及日常食用的藥膳提供了一定的抗病物質(zhì)基礎(chǔ)。

由表5可知，地參檢出的17 種氨基酸組分間物質(zhì)的量比存在差異，但廣西玉林和云南大理2 個產(chǎn)地之間相似度極高。

2.9 PCA結(jié)果

2.9.1 PC篩選及其貢獻率利用SPSS 20軟件對地參中17 種氨基酸進行PCA。如表6所示，從17 個氨基酸組分中提取出2 個PC（特征值＞1），PC1的特征值為15.210，特征貢獻率為89.473%，主要影響因子為脯氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸；PC2的特征值為1.176，特征貢獻率為6.917%，主要影響因子為精氨酸、蘇氨酸和谷氨酸；2 個PC的累計貢獻率為96.390%。

表6 方差分析Table 6 Analysis of variance

2.9.2 綜合PCA結(jié)果

表7 PC系數(shù)向量值Table 7 Vectors of principal components

表8 樣品PC得分、綜合得分及其排序Table 8 Principal component scores, comprehensive scores and their ranking

將表7中的系數(shù)向量值與17 種氨基酸含量標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，計算每個PC得分，根據(jù)每個PC所對應(yīng)的特征值占所提取PC總特征值之和的比例作為權(quán)重得到綜合PC表達式為F=0.928F1+0.072F2，并進行排序。如表8所示，相對于PC1，采自山東菏澤的地參得分最高；相對于對PC2，采自江蘇徐州的地參得分最高；綜合得分排序由高到低依次為山東菏澤＞云南騰沖＞江蘇徐州＞云南大理＞廣西玉林＞重慶萬州。不同產(chǎn)地地參的F值為-1.426～1.485，表明不同產(chǎn)地地參間氨基酸含量差異明顯。

2.10 聚類分析結(jié)果

圖2 樣品聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of samples

采用SPSS 20.0軟件對6 份樣品進行聚類分析，結(jié)果見圖2。當(dāng)歐式距離為15時，全部樣品被分成3 大類，其中山東菏澤的為第I類，營養(yǎng)價值最高，其余4 組為第II類，氨基酸品質(zhì)含量中等，重慶萬州為第III類，品質(zhì)相對較差，與PCA的結(jié)果一致。第I類山東菏澤地參為高品質(zhì)蛋白，可作為地參資源開發(fā)與利用的理想資源；第III類為低品質(zhì)蛋白，氨基酸含量可能與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境、種質(zhì)資源等[2]有關(guān)。聚類分析結(jié)果較好地體現(xiàn)了不同產(chǎn)地間氨基酸含量的差異性，為地參營養(yǎng)價值、藥用開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

3 結(jié) 論

本研究采用6 mol/L鹽酸溶液在110 ℃條件下對地參樣品進行水解，取水解液進行PITC柱前衍生，結(jié)合UPLC進行測定，計算得到地參中游離和水解氨基酸的總和。該方法的靈敏度高、分離效果好、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率良好，結(jié)果穩(wěn)定可靠。分析地參樣品中氨基酸的組成及含量，可以為地參藥材質(zhì)量評價和將其開發(fā)為保健品提供理論依據(jù)。

地參作為我國傳統(tǒng)藥食兩用的中藥材歷史悠久，其氨基酸種類豐富且含量較高，本研究中6 個不同產(chǎn)區(qū)的地參均含有17 種氨基酸，總含量約占地參質(zhì)量的5.00%即50 g/kg，極具開發(fā)作為補充氨基酸的功能性食品的潛力，豐富市場；檢出氨基酸中含有7 種必需氨基酸和9 種藥用氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，并通過PCA和聚類分析綜合評價，山東菏澤地參氨基酸總含量高，重慶萬州的相對較低。因此，建立地參栽培基地時，應(yīng)充分考慮地參對產(chǎn)地的適應(yīng)性。由于本實驗選擇的樣品產(chǎn)地僅限于5 個地參栽培?。ㄊ校┎⑽窗ㄎ覈械貐a(chǎn)地，且樣本數(shù)量較少并不能完全代表當(dāng)?shù)氐貐⑵焚|(zhì)，因此在今后研究中還需擴大采樣量和采樣范圍，調(diào)查生長環(huán)境和栽培技術(shù)，明確環(huán)境因素對地參氨基酸營養(yǎng)價值和藥用價值的影響，為地參品質(zhì)評價、產(chǎn)品的深入開發(fā)利用提供更多依據(jù)。