趙 磊，潘 飛，林文軒，徐美利，鮑 璽，陳艷麟，王成濤,*，連運(yùn)河,*

（1.北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，食品營養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；

2.晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司，河北 邯鄲 057250）

甜葉菊，屬多年草本菊科類植物，20世紀(jì)70年代從日本引進(jìn)回國，并大規(guī)模進(jìn)行種植，已在我國大部分地區(qū)形成特色的經(jīng)濟(jì)作物[1]。甜葉菊干葉含有豐富的甜菊糖苷，具有高甜度、低熱量等特點(diǎn)，其甜度約為蔗糖的300 倍，但熱量?jī)H為蔗糖的1/300，是一種天然的新型甜味替代劑[2]。當(dāng)前，我國甜菊糖出口位于世界第一，是世界上最大的甜菊糖生產(chǎn)供應(yīng)國[3]，然而，在食品工業(yè)生產(chǎn)甜菊糖的過程中產(chǎn)生大量的甜葉菊廢渣，這些廢渣并沒有得到合理的利用，對(duì)環(huán)境也造成了一定的污染。甜葉菊廢渣含有大量的粗蛋白、粗膳食纖維、黃酮類化合物、酚酸類化合物及微量元素等[4-5]，因此，甜葉菊廢渣具有很大的利用價(jià)值。有研究證實(shí)，甜葉菊廢渣能夠改善豬肌內(nèi)營養(yǎng)成分[6]。不僅如此，甜葉菊廢渣中的黃酮類及酚酸類物質(zhì)還具有抗氧化、降血脂、抑菌、抗衰老等功能[7-9]，因此，甜葉菊廢渣的功能活性及有效成分還有待深度研究，將為廢渣在綜合利用方面提供理論依據(jù)。

近年來研究表明甜葉菊提取物具有良好的抗氧化作用，通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)甜葉菊醇和水提取物具有自由基清除能力和鐵離子還原能力（ferric reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）[10-11]。此外，甜葉菊廢渣提取物具有1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）和2,2’-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiozoline-6)-sulphonic acid，

ABTS）陽離子自由基清除能力，且抗氧化能力優(yōu)于茶多酚[12]，通過建立D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甜葉菊廢渣提取物能夠顯著提高衰老小鼠血清、肝臟和腦內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和總抗氧化能力的活性[13]。同時(shí)，以溶劑萃取法制備的甜葉菊廢渣提取物生物制劑相比常規(guī)的抗氧化劑（丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯、特丁基對(duì)苯二酚等）及天然抗氧化劑（VC、VE等）表現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)[14]，上述研究擴(kuò)大了甜葉菊廢渣在天然抗氧化劑開發(fā)與利用方面的前景。采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[15]對(duì)甜葉菊廢渣提取物進(jìn)行成分鑒定，發(fā)現(xiàn)其8 種主要成分分別為綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷、槲皮素[13,16-17]，這些成分的存在可能為甜葉菊廢渣提取物的抗氧化作用做出貢獻(xiàn)。然而，近年來的研究主要集中在甜葉菊廢渣中多酚黃酮類化合物的提取純化工藝研究及含量測(cè)定等方面[4,18-19]，對(duì)甜葉菊廢渣提取物中主要成分的抗氧化研究還不充分，尤其在對(duì)其主要成分抗氧化能力的強(qiáng)弱分析及各成分對(duì)廢渣提取物總抗氧化能力的貢獻(xiàn)度等方面，這些研究不僅能夠?yàn)樘鹑~菊廢渣提取物的成分和其抗氧化能力之間的關(guān)系提供參考價(jià)值，還有助于甜葉菊廢渣的開發(fā)利用。

本實(shí)驗(yàn)以甜葉菊廢渣提取物為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）及HPLC法對(duì)提取物主要成分進(jìn)行定性和定量分析，并使用標(biāo)準(zhǔn)品按照甜葉菊廢渣提取物中各主要成分的原始含量制備模擬提取物，基于DPPH法、FRAP法及trolox等效抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）法3 種抗氧化方法對(duì)8 種主要成分進(jìn)行抗氧化評(píng)價(jià)，并闡明這8 種主要成分對(duì)甜葉菊廢渣提取物的抗氧化貢獻(xiàn)度，進(jìn)一步完善甜葉菊廢渣提取物體外抗氧化性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜葉菊廢渣提取物 河北晨光生物科技集團(tuán)股份有限公司；DPPH、2,4,6-三吡啶基三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、ABTS 美國Sigma公司；綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷、槲皮素 成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（HPLC級(jí)） 美國Mallinckrodt Baker制藥公司；其他化學(xué)品均屬國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；6530 HPLC-MS/MS儀、1290 HPLC系統(tǒng) 美國安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 甜葉菊廢渣提取物的制備

甜菊糖絮凝廢渣→酸性丙酮水溶液萃取→濃縮→乙酸乙酯萃取→乙酸乙酯溶液濃縮→大孔吸附樹脂純化→干燥→甜葉菊廢渣提取物

1.3.2 甜葉菊廢渣提取物中主要成分的鑒定及定量分析

采用HPLC-MS/MS對(duì)甜葉菊廢渣提取物中主要成分進(jìn)行鑒定，并采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行定量分析，結(jié)果以每克甜葉菊廢渣提取物中各主要成分物質(zhì)的毫克數(shù)表示[13]。

HPLC條件：流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-甲醇溶液；流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液；流速0.1 mL/min；洗脫程序，0～10 min，10%～50% A，9 0%～5 0% B；1 0 ～1 2 m i n，5 0%～1 0% A，50%～90% B；12～15 min，10% A，90% B；檢測(cè)波長：320 nm和360 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量1 μL；樣品質(zhì)量濃度1 mg/mL。

質(zhì)譜條件：m/z 100～1 500；干燥氣體N2；溫度300 ℃；流速3 L/min；噴霧器壓力35 psig；毛細(xì)管電壓3.5 kV；毛細(xì)管出口電壓135 V；錐孔電壓65 V。按照上述質(zhì)譜條件，獲得甜葉菊廢渣提取物中主要色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜的分子離子及二級(jí)質(zhì)譜的碎片離子。將二者的分子質(zhì)量與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行比較，推測(cè)出色譜峰的可能組成，并采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行驗(yàn)證。

采用標(biāo)準(zhǔn)品（咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮素和槲皮苷），按上述HPLC條件分別進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（6.25～200 μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定甜葉菊廢渣提取物（1 mg/mL）中各主要成分的含量，結(jié)果以mg/g提取物計(jì)。

1.3.3 抗氧化活性測(cè)定方法

1.3.3.1 DPPH法

在試管中加入0.1 m L 樣品甲醇溶液，3.9 m L 0.025 mg/mL DPPH-甲醇溶液。將樣品劇烈振蕩并于暗處室溫靜置1 h，穩(wěn)定后用分光光度計(jì)測(cè)定在517 nm波長處吸光度[20]，采用甲醇代替樣品測(cè)量結(jié)果作為空白對(duì)照，樣品質(zhì)量濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL，根據(jù)DPPH自由基清除率公式進(jìn)行計(jì)算，并將不同質(zhì)量濃度的樣品與DPPH自由基清除率的關(guān)系，制作回歸方程。結(jié)果用EC50值表示，即DPPH自由基清除率達(dá)到50%所需樣品的質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.3.2 TEAC法

將7 mmol/L ABTS的K2S2O8溶液（2.45 mmol/L）在室溫避光保存16 h，制得ABTS陽離子自由基儲(chǔ)備液。經(jīng)PBS（pH 7.4）稀釋，使其在734 nm波長處的吸光度達(dá)到（0.70±0.02），得到ABTS陽離子自由基工作液。設(shè)置樣品質(zhì)量濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL，并在試管中加入80 μL樣品溶液或者蒸餾水，并與3.92 mL的ABTS陽離子自由基工作液混合，暗處反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm波長處吸光度[20]，根據(jù)ABTS陽離子自由基消除率公式進(jìn)行計(jì)算，并將不同濃度的樣品與ABTS陽離子自由基消除率的關(guān)系，制作回歸方程。結(jié)果用EC50值表示，即ABTS陽離子自由基清除率達(dá)到50%所需要的樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3.3.3 FRAP法

將25 mL 0.3 mol/L醋酸緩沖液（pH 3.6），2.5mL 10 mmol/L TPTZ溶液（溶解在40mmol/L HCl中）及2.5 mL 20 mmol/L FeCl3·6H2O混合配制FRAP試劑。在試管中加入3 mL新配制的FRAP試劑，37 ℃預(yù)熱，設(shè)置樣品質(zhì)量濃度梯度為6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL，向新配制的FRAP試劑加入0.1 mL上述質(zhì)量濃度樣品溶液及0.3 mL蒸餾水。將樣品搖勻，置37 ℃的水浴中30 min，然后測(cè)量595 nm波長處反應(yīng)后的混合物的吸光度[20]。將不同濃度的FeSO4溶液代替樣品，其余操作同上，建立質(zhì)量濃度與吸光度的線性回歸方程（y=0.659 6x-0.01，R2=0.999 6）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的EC1值（EC1=C樣品/CFe2+，即與1 mmol/L FeSO4溶液具有相同抗氧化活性的樣品質(zhì)量濃度（μg/mL））。

1.3.4 模擬提取物制備及抗氧化能力的測(cè)定

如1.3.2節(jié)所述測(cè)定出甜葉菊廢渣提取物中主要成分，并根據(jù)這些主要成分在甜葉菊廢渣提取物的實(shí)際含量使用標(biāo)準(zhǔn)品配制得到模擬提取物，并設(shè)置不同質(zhì)量濃度（6.25、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL），采用上述3 種抗氧化方法評(píng)價(jià)其抗氧化活性。

1.3.5 抗氧化性貢獻(xiàn)率的計(jì)算方法

參照李洋等[21]報(bào)道的方法并作出少量修改研究甜葉菊廢渣提取物中各主要成分對(duì)甜葉菊廢渣提取物總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAC）的貢獻(xiàn)率，計(jì)算公式為：

式中：EEC1（EC1當(dāng)量）表示每克甜葉菊廢渣提取物中每種主要成分的含量/每種主要成分的EC1；EEC50（EC50當(dāng)量）表示每克甜葉菊廢渣提取物中每種主要成分的含量/每種主要成分的EC50；TAC表示每克甜葉菊廢渣提取物/甜葉菊廢渣提取物的EC1或者EC50。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果均使用±s表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。使用抗氧化活性綜合（antioxidant potency composite，APC）指數(shù)法[22]進(jìn)行主要成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單體抗氧化活性比較，按照下式計(jì)算APC指數(shù)及APC綜合指數(shù)：

2 結(jié)果與分析

2.1 甜葉菊廢渣提取物的主要成分鑒定及定量分析

對(duì)甜葉菊廢渣提取物中的主要成分進(jìn)行高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-diode array detection-electrospray ionisation tandem mass spectrometry，HPLC-DAD-ESI/MS）分析，在320 nm和360 nm波長處分別對(duì)羥基肉桂衍生物和黃酮類化合物進(jìn)行HPLC-DAD檢測(cè)，并與在360 nm波長處的標(biāo)準(zhǔn)品混合液的色譜圖進(jìn)行對(duì)比，甜葉菊廢渣提取物分離得到8 種主要成分（圖1），其對(duì)應(yīng)的MS2質(zhì)譜圖如圖2所示。通過與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和裂解方式的比較[23]，化合物1和化合物2（m/z 353）鑒定為綠原酸和隱綠原酸，它們的去質(zhì)子化分子離子[M-H]－在m/z 191、179、173和135處產(chǎn)生4 個(gè)主要MS2質(zhì)譜特征碎片斷，分別代表[奎寧酸-H]－、[咖啡酰氧基-H]－、[奎寧酸-H-H2O]－、[咖啡酰氧基-H-COO]－。通過對(duì)保留時(shí)間、MS和MS2質(zhì)譜圖與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的比較[24]，確定了m/z 179的化合物為咖啡酸（圖2C）。由圖1和圖2D～F顯示，根據(jù)洗脫順序、裂解規(guī)律和相對(duì)豐度的差異[25]，化合物4、5、6（m/z 515）被鑒定為異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C?；衔?（m/z 447）經(jīng)鑒定為槲皮素-3-鼠李糖苷，其MS2質(zhì)譜在m/z 301處有特征片段存在，表明鼠李糖片段（m/z 146）從槲皮苷中斷裂（圖2G）?；衔?的分子離子峰為m/z 301，推測(cè)其為槲皮素苷元，MS2質(zhì)譜圖中的m/z 179（X－）離子則是由于A環(huán)和B環(huán)斷裂形成的[26]。根據(jù)上述HPLC-DAD-ESI/MS結(jié)果，從甜葉菊廢渣提取物中鑒定出8 種主要化合物A～H，分別為綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮苷、槲皮素，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖1 甜葉菊廢渣提取物和標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC-DAD譜圖Fig. 1 HPLC-DAD chromatograms of stevia residue extract and standard mixture

圖2 甜葉菊廢渣提取物各主要成分色譜峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖Fig. 2 Tandem mass spectra of the main components of stevia residue extract

圖3 甜葉菊廢渣提取物中8 種主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 3 Chemical structures of the eight main compounds present in stevia residue extract

采用高效液相色譜法，以8 種標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度（6.25～200 μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線（咖啡酸：y=26.994x+8 5.2 0 4，R2=0.9 9 8 4；綠原酸：y=1 3.1 5 7 x+3 0.7 0 6，R2=0.9 9 9 7；隱綠原酸：y=1 1.5 1 8 x+72.826，R2=0.997 5；異綠原酸A：y=12.798x+6 1.2 3，R2=0.9 9 7 9；異綠原酸B：y=1 5.5 9 1 x+8.255 7，R2=0.999 8；異綠原酸C：y=10.199x+24.81，R2=0.999 9；槲皮素：y=17.715x+72.648，R2=0.996 7；槲皮苷：y=7.66x+38.421，R2=0.996 5），對(duì)甜葉菊廢渣提取物中的8 種主要化合物進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，甜葉菊廢渣提取中富含酚酸類化合物，其中以異綠原酸C、咖啡酸和綠原酸的含量為最高，約占甜葉菊廢渣提取物的12.67%、9.72%和4.65%，而槲皮苷和槲皮素含量相對(duì)較低，僅占1.88%和0.71%，這8 種主要成分含量約占甜葉菊廢渣提取物的39.83%。然而，有些酚類化合物的含量非常低，很難被檢測(cè)[18]，因此仍可能存在一些還未識(shí)別的酚酸類化合物。此外，在甜葉菊廢渣提取物中還可能含有其他成分。因此，為了更好地了解甜葉菊廢渣提取物的構(gòu)成，還需要對(duì)其他成分進(jìn)一步深入研究。

表1 甜葉菊廢渣提取物主要成分的含量Table 1 Contents of the eight main compounds present in stevia residue extract

2.2 甜葉菊廢渣提取物主要成分抗氧化能力比較

EC50值越低則該物質(zhì)清除自由基的能力最強(qiáng)。如表2和圖4所示，在DPPH自由基捕獲法中，8 種主要成分清除DPPH自由基的能力由大到小依次排序?yàn)椋嚎Х人幔井惥G原酸B＞槲皮素＞綠原酸＞異綠原酸A ＞隱綠原酸＞異綠原酸C ＞槲皮苷，其中咖啡酸對(duì)DPPH自由基清除作用最強(qiáng)，其EC50值為（54.25±3.32）μg/mL，其DPPH自由基清除能力是槲皮苷（EC50=（334.51±11.94）μg/mL）的6.5 倍。

表2 甜葉菊廢渣提取物主要成分的抗氧化能力Table 2 Antioxidant activities of the main components of stevia residue extract

在ABTS陽離子自由基清除實(shí)驗(yàn)中，8 種主要成分清除ABTS陽離子自由基的能力由大到小依次排序?yàn)椋壕G原酸＞槲皮素＞異綠原酸B＞咖啡酸＞槲皮苷＞異綠原酸A＞異綠原酸C＞隱綠原酸。其中綠原酸對(duì)ABTS陽離子自由基清除率作用最強(qiáng)，其EC50值為（40.02±1.97）μg/mL，其ABTS陽離子自由基的清除能力是隱綠原酸（EC50=（90.02±10.72）μg/mL）的2.25 倍。

在FRAP測(cè)定方法中，EC1常用來衡量與1 mmol/L FeSO4溶液具有相同抗氧化活性的樣品濃度，EC1值越低，則Fe3+還原能力越強(qiáng)。8 種主要成分Fe3+還原能力由大到小的順序依次是：咖啡酸＞異綠原酸B＞槲皮素＞綠原酸＞異綠原酸A＞隱綠原酸＞異綠原酸C＞槲皮苷，其中咖啡酸的Fe3+還原能力最強(qiáng)，其EC1值為（27.90±0.63）μg/mL，是槲皮苷（EC1=（120.60±0.81）μg/mL）的4.3 倍。

由上述結(jié)果可知，甜葉菊廢渣提取物中8 種主要成分在3 種抗氧化方法中的測(cè)定結(jié)果并不一致，主要因?yàn)楦鞣宇惖慕Y(jié)構(gòu)性質(zhì)[27]及各種方法反應(yīng)原理[20]不同，所以無法全面評(píng)價(jià)各單一成分的抗氧化活性。因此，采用APC指數(shù)法[22]對(duì)3 種方法測(cè)得結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果見圖4和表3。

圖4 甜葉菊廢渣提取物中8 種主要成分抗氧化活性APC指數(shù)Fig. 4 APC index of the eight main components in stevia residue extract

表3 甜葉菊廢渣提取物8 種主要成分物質(zhì)抗氧化活性及排序Table 3 APC index for individual and total antioxidant activities of the eight main components of stevia residue extract and their ranking

甜葉菊廢渣提取物中8 種主要成分的APC指數(shù)由大到小的順序是：咖啡酸（92.56%）＞槲皮素（78.31%）＞異綠原酸B（62.09%）＞綠原酸（58.92%）＞異綠原酸A（48.15%）＞異綠原酸C（36.55%）＞隱綠原酸（35.5%）＞槲皮苷（34.24%）。其中咖啡酸APC指數(shù)最高（92.56%），抗氧化能力最強(qiáng)，相當(dāng)于APC指數(shù)最低的槲皮苷（34.24%）的2.7 倍。張華等[27]對(duì)15 種柑橘果皮中主要酚類進(jìn)行抗氧化比較，結(jié)果顯示抗氧化由強(qiáng)到弱的順序?yàn)椋簺]食子酸＞咖啡酸＞綠原酸＞阿魏酸＞圣草酚＞圣草次苷＞蘆?。境绕に兀捐制に兀镜貖W司明＞橙皮苷＞川陳皮素＞甜橙黃酮＞柚皮苷＞橘皮素。與本實(shí)驗(yàn)中采用APC指數(shù)法比較發(fā)現(xiàn)的咖啡酸抗氧化活性高于與綠原酸抗氧化活性的結(jié)果一致?，F(xiàn)有研究表明，不同酚類化合物的抗氧化活性差異不僅與酚羥基的糖基化、甲氧化有關(guān)，還與酚羥基的數(shù)目、取代基位置、有無C2、C3位雙鍵等相關(guān)[27]。在酚類結(jié)構(gòu)方面咖啡酸的羧基與奎尼酸發(fā)生酯化反應(yīng)形成綠原酸，槲皮素經(jīng)糖基化后形成槲皮苷，這些反應(yīng)引起結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致抗氧化能力下降[28-29]。此外，酚羥基在連接位置、數(shù)量等結(jié)構(gòu)上的差異也會(huì)導(dǎo)致在不同體系中的抗氧化能力有所不同，李佳銀等[30]采用5 種抗氧化方法對(duì)甘薯莖葉中咖啡?；鼘幩犷愌苌镞M(jìn)行抗氧化比較，結(jié)果顯示異綠原酸B和異綠原酸A抗氧化活性高于異綠原酸C，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。

酚類抗氧過能力對(duì)質(zhì)量濃度具有依賴性[30]，鑒于8 種主要成分在甜葉菊廢渣提取物中含量不同，因此，以200 μg/mL質(zhì)量濃度的甜葉菊廢渣提取物為例，采用3 種抗氧化方法（DPPH、TEAC、FRAP法）計(jì)算提取物中8 種主要成分對(duì)提取物抗氧化性貢獻(xiàn)率如圖5所示，咖啡酸對(duì)甜葉菊廢渣提取物總抗氧化性能力貢獻(xiàn)率最大，這一結(jié)果與上述論證基本一致。

圖5 主要成分對(duì)甜葉菊廢渣提取物總抗氧化性貢獻(xiàn)率Fig. 5 Contribution percentages of the main components to the total antioxidant activity of stevia residue extract

2.3 8 種主要成分對(duì)甜葉菊廢渣提取物抗氧化活性的貢獻(xiàn)

圖6 甜葉菊廢渣提取物與模擬樣品體外抗氧法活性Fig. 6 Antioxidant activities of stevia residue extract and its simulant in vitro

按照甜葉菊廢渣提取物中8 種主要成分實(shí)際含量制備獲得模擬提取物，采用3 種抗氧化方法對(duì)模擬提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并與甜葉菊廢渣提取物（實(shí)際提取物）比較分析。如圖6所示，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)（50～400 μg/mL），甜葉菊廢渣提取物的自由基（DPPH、ABTS）清除能力和FRAP均大于模擬提取物。在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，模擬提取物的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除能力法分別為甜葉菊廢渣提取物的76.57%和33.36%，模擬提取物的Fe3+還原能力約為甜葉菊廢渣提取物的44.13%。3 種方法對(duì)模擬提取物抗氧化能力的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，抗氧化能力的強(qiáng)弱為：甜葉菊廢渣提取物（實(shí)際提取物）＞模擬提取物。對(duì)這種差異性的解釋為：甜葉菊廢渣提取物（實(shí)際提取物）中成分較為復(fù)雜，除8 種主要成分外，還可能含有較低濃度的未鑒定出的酚酸類（香豆?？鼘幩?、三咖啡?？鼘幩岬龋┖忘S酮類化合物[16]，這些物質(zhì)具有抗氧化活性，常與酚酸類物質(zhì)之間產(chǎn)生相互作用使酚羥基發(fā)生變化，而酚羥基的數(shù)目對(duì)自由基消除、鐵離子還原表現(xiàn)出較高的顯著性，因此表現(xiàn)出協(xié)同作用[29]。

3 結(jié) 論

通過HPLC-MS/MS和HPLC法對(duì)甜葉菊廢渣提取物的主要成分進(jìn)行分析，得出8 種主要成分：綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、槲皮苷和槲皮素，其中異綠原酸C（126.7±1.27）mg/g含量最高、其次為咖啡酸（97.2±0.36）mg/g、綠原酸（46.5±0.29）mg/g。采用APC指數(shù)法對(duì)8 種主要成分的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出抗氧化能力最強(qiáng)為咖啡酸，且其對(duì)甜葉菊廢渣提取物抗氧化活性貢獻(xiàn)最大。通過對(duì)模擬提取物和甜葉菊廢渣提取物的抗氧化性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量濃度為50～400 μg/mL時(shí)，甜葉菊廢渣提取物的抗氧化能力均強(qiáng)于模擬提取物。這表明除8 種主要成分外，甜葉菊廢渣提取物中還存在其他抗氧化活性物質(zhì)，還有待于進(jìn)一步探究。