吳永祥,王婷婷,張夢婷,張 瑤,郭孝成,孫漢巨,陳向陽,*
(1.黃山學院生命與環(huán)境科學學院,安徽 黃山 245041;2.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院,安徽 合肥 230009)
臭鱖魚是我國安徽黃山地區(qū)的傳統(tǒng)自然發(fā)酵食品,是以新鮮鱖魚為原料,配以一定量的香辛料,經低鹽、低溫、短期腌制發(fā)酵而成,具有悠久的歷史和獨特的地域風味。經過發(fā)酵作用,鱖魚體內的蛋白質、脂肪及核酸等分子被降解成氨基酸、多肽、脂肪酸、核苷酸及醛、醇、酮等風味物質,營養(yǎng)價值得到提高,風味品質發(fā)生變化,并賦予了發(fā)酵后鱖魚似臭非臭、鮮香透骨、魚肉酥爛的特點[1-2]。目前,徽州臭鱖魚的加工方法以傳統(tǒng)的自然發(fā)酵為主,即通過魚體自身攜帶的微生物在適宜溫度條件下自然發(fā)酵形成的,臭鱖魚的質構特性、特征氣味形成與發(fā)酵微生物有關,但參與發(fā)酵的微生物多樣且群落結構復雜,使得發(fā)酵過程中的工藝參數不可控、發(fā)酵后臭鱖魚的質量品質不穩(wěn)定[3]。因此,分析傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚的微生物多樣性對于了解其品質質量至關重要。李燕等[4]采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)技術分析了臭鱖魚發(fā)酵過程中的細菌群落結構,結果發(fā)現不同樣本臭鱖魚的微生物群落結構存在一定差異。羅靚芷等[5]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法分離純化得到屎腸球菌、彎曲乳桿菌、堅強腸球菌、干酪乳桿菌4 株優(yōu)良乳酸菌。楊培周等[6]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法篩選鱖魚主要發(fā)酵微生物,分離鑒定出蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得臭鱖魚的純培養(yǎng)菌株非常有限,存在一定的局限性和片面性。高通量測序技術通量高、準確率高,可定性及相對定量解析復雜微生物群落結構體系,是一種有效、便捷的方法,被廣泛應用于豆醬、米酒、酒曲、酸奶、泡菜等發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究[7-9]。本研究采用高通量測序技術對發(fā)酵前后鱖魚中細菌群落結構進行對比分析,解析各類微生物的結構比例,明確優(yōu)勢菌群,并從營養(yǎng)成分、理化性質、質構特性等角度分析發(fā)酵品質,為準確認識臭鱖魚的微生物群落結構組成及發(fā)酵品質提供數據參考。
酶解技術是食品精深加工的一項綠色加工手段,通過選擇性的可控酶解,促進被多種共存雜質干擾的多糖、多肽等活性成分的釋放,并可協(xié)同微生物發(fā)酵,應用于提高發(fā)酵后產品的品質[10-11]。包汭琪等[12]研究了木瓜蛋白酶添加對臭鱖魚揮發(fā)性成分和細菌群落結構之間的影響,表明木瓜蛋白酶的添加能顯著提高游離氨基酸含量,并促進臭鱖魚中風味物質的形成。王翠等[13]采用中性酶對臭鱖魚肉糜進行蛋白質水解,并對影響水解反應的因素如酶的添加量、酶解溫度、pH值和液固比進行研究,確定了最佳工藝條件。然而,目前缺乏不同蛋白酶酶解處理對發(fā)酵后臭鱖魚品質影響的深入研究。本研究采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對發(fā)酵后臭鱖魚進行酶解,擬通過微生物發(fā)酵、酶解兩步法提高不同酶解產物的可溶性多肽含量、增強不同酶解產物清除2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基能力及還原能力,以期為徽州臭鱖魚的微生物與酶協(xié)同發(fā)酵及提高臭鱖魚應用價值提供科學依據。
未發(fā)酵鱖魚和發(fā)酵后徽州臭鱖魚,由安徽徽字一號投資有限公司提供。
DPPH、VC、牛血清白蛋白(bovine serumalbumin,BSA)、ABTS 美國Sigma公司;酸性蛋白酶(100 000 U/g)、堿性蛋白酶(200 000 U/g)滄州夏盛酶生物技術有限公司;中性蛋白酶(50 000 U/g)河南仰韶生化工程有限公司;木瓜蛋白酶(200 000 U/g)南寧龐博生物工程有限公司;蒽酮、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 國藥集團化學試劑公司。
CR-10plus色差儀 日本柯尼卡美能達公司;GY-4數顯式硬度計 北京金科利達電子科技有限公司;SpectraMax-190全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司;S3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;DL-CJ-1N型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SQ510C型高壓滅菌器 重慶雅馬拓科技有限公司;MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司;LabStart-Aw便攜式水活度測定儀 瑞士Novasina公司。
1.3.1 發(fā)酵前后鱖魚微生物宏基因組DNA提取及檢測
在無菌超凈工作臺中,分別剪取發(fā)酵前后鱖魚不同部位魚肉組織,各自隨機混合。稱取20 g魚肉組織,加入50 mL生理鹽水,均質5 min。過濾后,取上清液于10 000 r/min離心10 min,棄去上清液,沉淀重懸浮于1 mL TE buffer,-80 ℃保存?zhèn)溆肹14]。用Omega細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取發(fā)酵前后鱖魚中細菌的總DNA,具體操作步驟見說明書。提取后,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。
1.3.2 PCR擴增以及高通量測序
細菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域擴增采用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。PCR擴增及高通量測序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。
1.3.3 發(fā)酵前后鱖魚理化性質的測定
水分含量的測定:參照GB 5009.3—2016《食品中水分測定》方法;水分活度的測定:采用LabStart-Aw便攜式水分活度測定儀,具體操作步驟見說明書;灰分含量的測定:參照GB 5009.4—2016《食品中灰分測定》方法;粗蛋白含量的測定:參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質測定》方法。
可溶性多肽含量的測定:采用雙縮脲法[15]。繪制BSA標準曲線,以吸光度(Y)為縱坐標,BSA質量濃度(X/(mg/mL))為橫坐標,得到回歸方程為:Y=0.079 9X+0.088 8(R2=0.996 3)。根據BSA標準曲線計算樣品中多肽含量,結果以每100 g魚肉中含有相當BSA質量表示,即g/100 g。
可溶性總糖含量的測定:采用蒽酮比色法[16]。繪制葡萄糖標準曲線,以吸光度(Y)為縱坐標,葡萄糖質量濃度(X/(mg/mL))為橫坐標,得到回歸方程為:Y=3.233 4X+0.008 2(R2=0.998 5)。根據葡萄糖標準曲線計算樣品中可溶性總糖含量,結果以每100 g魚肉中含有相當葡萄糖質量表示,即mg/100 g。
1.3.4 發(fā)酵前后鱖魚質構特性的測定
硬度值采用GY-4型數顯式硬度計測定,探頭直徑為7.9 mm,分別在發(fā)酵前后鱖魚表面隨機選取10 個點測量,并記錄數據,計算其平均值,單位為kg/cm2。
色澤測定利用CR-10 plus型色差儀,在發(fā)酵前后鱖魚表面隨機選取10 個點測量,并記錄L*、a*、b*值,計算其平均值。
微觀組織結構觀察利用S3400N型掃描電子顯微鏡,將發(fā)酵前后鱖魚魚肉凍干后,固定在樣品托上,采用離子濺射儀在樣品的橫斷面上噴金,掃描電子顯微鏡(500、2 000 倍)觀察并拍照[17]。
1.3.5 發(fā)酵臭鱖魚蛋白酶解液的制備流程
臭鱖魚肉糜→加入一定量的滅菌水攪拌均勻→酶解→滅酶(沸水浴10 min)→冷卻→離心(3 500 r/min,20 min)→取上清液→多肽含量測定
1.3.6 酶解條件的選擇
選擇酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶作為蛋白質水解酶,分別在各種酶最佳溫度、pH值條件下對臭鱖魚行水解。參考文獻[13],統(tǒng)一為加酶量2 000 U/g、料液比1∶20(g/mL)、酶解時間1.5 h。同時設立對照組,為未添加酶處理。
1.3.7 酶解產物抗氧化活性的測定
ABTS陽離子自由基清除能力的測定參考文獻[18];DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[19-20];還原能力的測定參考文獻[21]。酶解產物的抗氧化能力以半數抑制濃度(IC50)表示,IC50指的是清除率為50%時或OD值達到0.5時,所需要樣品的有效質量濃度,可根據不同質量濃度的清除率作曲線方程求出。同時設立VC為陽性對照。
表1 發(fā)酵前后鱖魚的細菌菌群α多樣性分析Table 1 Bacterial α diversity indexes of fermented and fresh mandarin fish
由表1可知,未發(fā)酵鱖魚和發(fā)酵后臭鱖魚細菌菌群的覆蓋率都達到99%以上,說明樣本文庫測序結果能反映樣品真實情況,可用于樣品細菌多樣性分析。未發(fā)酵鱖魚細菌菌群的Chao l指數平均值為27.13,Shannon指數平均值為1.36,ACE指數平均值為29.34;發(fā)酵后臭鱖魚細菌菌群的Chao l指數平均值為68.93,Shannon指數平均值為1.67,ACE指數平均值為67.89。從Chao l指數和ACE指數可以看出,發(fā)酵后臭鱖魚的細菌菌群豐度高于未發(fā)酵鱖魚細菌菌群豐度。發(fā)酵后臭鱖魚中細菌Shannon指數也明顯高于未發(fā)酵鱖魚,說明發(fā)酵后臭鱖魚中細菌菌群多樣性高于未發(fā)酵鱖魚。因此,傳統(tǒng)發(fā)酵臭鱖魚中細菌菌群多樣性更加豐富。
圖1 門水平上發(fā)酵前后鱖魚的細菌豐度分析Fig. 1 Relative abundance of bacteria in fermented and fresh mandarin fish at the phylum level
由圖1 可知,在門水平上,發(fā)酵前鱖魚總細菌群落主要由變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)組成,相對豐富分別為74.55%、25.45%。發(fā)酵后臭鱖魚的總細菌群落組成仍以變形菌門和厚壁菌門為主,占據菌群總量的90.34%,余下9.37%為Epsilonbacteraeota、梭桿菌門(Fusobacteria)。由此說明,徽州臭鱖魚是通過魚體自身攜帶的微生物在適宜溫度條件下自然發(fā)酵形成的,變形菌門和厚壁菌門是臭鱖魚發(fā)酵的主要優(yōu)勢細菌。
由圖2 可知,在屬水平上,發(fā)酵前后鱖魚的微生物多樣性與豐度有明顯差異。發(fā)酵前鱖魚共分離得到8 個屬,相對豐富大于1%的菌群為假單胞菌屬(Pseudomonas)、肉桿菌屬(Carnobacterium)、沙雷氏菌屬(Serratia)、漫游球菌屬(Vagococcus)、環(huán)絲菌屬(Brochothrix)、乳桿菌屬(Lactobacillus)及冷桿菌屬(Psychrobacter)。發(fā)酵前鱖魚中假單胞菌屬和肉桿菌屬的優(yōu)勢較為明顯,分別為總水平的69.30%和17.33%。發(fā)酵后臭鱖魚共分離得到14 個屬,與發(fā)酵前鱖魚相比,發(fā)酵后臭鱖魚的總細菌群落組成發(fā)生變化,主要由冷桿菌屬、漫游球菌屬、弓形桿菌屬(Arcobacter)及Psychrilyobacter組成,相對豐度分別為59.96%、26.97%、7.21%及1.23%。冷桿菌屬微生物在臭鱖魚發(fā)酵中占有優(yōu)勢,對臭鱖魚發(fā)酵起重要作用。已有報道表明,冷桿菌屬是低溫發(fā)酵食品的主要優(yōu)勢菌群,在冷鮮肉、海產品及牛奶中都十分常見[14,22]。同時,本研究從發(fā)酵后臭鱖魚中檢測出乳桿菌屬,與羅靚芷[5]和Dai Zhiyuan[23]等傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的研究結果一致。乳酸菌能賦予發(fā)酵臭鱖魚柔和的酸味,改善產品風味,促進發(fā)酵成熟。
圖2 發(fā)酵前后鱖魚的屬水平上細菌豐度分析Fig. 2 Relative abundance of bacteria in fermented and fresh mandarin fish at the genus level
表2 發(fā)酵前后鱖魚理化性質的比較Table 2 Comparison of physicochemical properties of fermented and fresh mandarin fish
由表2可知,相比于未發(fā)酵組,發(fā)酵后臭鱖魚的pH值及水分含量、水分活度、粗蛋白含量略降低。臭鱖魚的水分含量及水分活度下降,可能與發(fā)酵前期臭鱖魚加入食鹽腌制中,魚肉脫水致使含水量降低以及與發(fā)酵后期pH值的下降引發(fā)了蛋白質變性,使其魚肉持水能力降低等有關。發(fā)酵后臭鱖魚的灰分、可溶性多肽、可溶性總糖含量較發(fā)酵前均明顯提高,分別增加了95.10%、50.00%、209.20%。臭鱖魚灰分含量的增加,與發(fā)酵過程中加入食鹽腌制有關。
目前已有多篇文獻報道了發(fā)酵食品微生物群落與其理化指標具有一定的相關性:如姜靜[24]研究表明自然發(fā)酵豆醬的pH值與乳桿菌、假單胞菌、環(huán)絲菌等呈現極顯著負相關,蛋白質和脂肪含量與乳桿菌、明串珠菌和環(huán)絲菌呈現極顯著正相關;Broekaert等[25]研究發(fā)現細菌Psychrilyobacterspp.、Pseudoalteromonasspp.是褐蝦在保藏過程中揮發(fā)性成分(硫化物、酮類、氨類、醇類等成分)產生的主要優(yōu)勢菌群;孫瑛等[26]研究表明海水魚腌制過程細菌群落多樣性和N-亞硝胺變化呈現一定相關性,嗜冷桿菌屬為優(yōu)勢菌群。本研究對發(fā)酵前后鱖魚的理化指標與細菌變化進行相關性分析,結果如表3所示。漫游球菌屬與pH值、粗蛋白含量呈顯著負相關(P<0.05),假單胞菌屬、肉桿菌屬、沙雷氏菌屬和乳桿菌屬與pH值呈顯著正相關(P<0.05)。漫游球菌屬與可溶性多肽、可溶性總糖含量呈顯著正相關(P<0.05),相關性系數(r)分別為0.999和0.999,表明在發(fā)酵過程中漫游球菌屬能合成蛋白酶、碳水化合物活性酶等,促進了蛋白質、碳水化合物的分解,致使發(fā)酵后粗蛋白含量下降,而可溶性多肽、可溶性總糖含量顯著上升[27]。結果揭示了發(fā)酵前后鱖魚的理化指標與細菌群落呈現顯著相關性,而細菌群落代謝的復雜酶體系可能是引起發(fā)酵前后鱖魚理化性質發(fā)生變化的主要原因。
表3 理化指標與細菌相關性分析Table 3 Correlation analysis between physicochemical indexes and bacterial genera in stinky mandarin fish
表4 發(fā)酵前后鱖魚硬度、色澤的比較Table 4 Comparison of hardness and color parameters of fermented and fresh mandarin fish
由表4可知,未發(fā)酵鱖魚的硬度值為(2.10±0.10)kg/cm2,發(fā)酵后臭鱖魚的硬度值增加到(3.95±0.09)kg/cm2,提高了0.88 倍。L*值表示發(fā)酵前后鱖魚魚肉的明暗度,L*值越大表明顏色越白。與未發(fā)酵鱖魚相比,發(fā)酵后臭鱖魚的L*值減少,魚肉呈現灰白色;發(fā)酵前后鱖魚的b*值亦存在差異,發(fā)酵后臭鱖魚的b*值顯著增加,魚肉顏色呈現淡黃色[28]。如圖3所示,與未發(fā)酵鱖魚相比,發(fā)酵后臭鱖魚的組織結構形態(tài)發(fā)生了顯著改變,外表面干燥,脫水嚴重,組織結構出現嚴重皺縮,卷曲現象更明顯,魚肉間形成了較為清晰的紋路。發(fā)酵前后鱖魚微觀結構掃描電鏡觀察結果與前期研究的水分含量、水分活度及硬度具有一定的吻合度[29],從微觀結構上對發(fā)酵前后鱖魚質構特性差異進行了進一步的驗證。
圖3 發(fā)酵前后鱖魚微觀組織結構的比較Fig. 3 Comparison of microstructure of fermented and fresh mandarin fish
選用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶分別在最適條件下對臭鱖魚肉糜進行酶解,以可溶性多肽含量為評價指標,結果如表5所示。不同蛋白酶酶解液中可溶性多肽含量差異顯著(P<0.05),其中堿性蛋白酶的酶解程度最高,可溶性多肽含量可達(4.97±0.18)g/100 g;未處理組中可溶性多肽含量最低,為(1.32±0.13)g/100 g,顯著低于其他4 種蛋白酶處理組(P<0.05)。4 種蛋白酶酶解能力從大到小依次為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶=酸性蛋白酶。包汭琪[12]和王翠[13]等研究表明,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶能有效促進臭鱖魚中蛋白質水解,游離氨基酸含量顯著提升。
表5 臭鱖魚的不同蛋白酶酶解產物可溶性多肽含量的比較Table 5 Comparison of soluble polypeptide contents in different protease hydrolysates of stinky mandarin fish
表6 臭鱖魚酶解產物對ABTS陽離子自由基的清除作用Table 6 ABTS cation radical- scavenging ability of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish
由表6可知,臭鱖魚4 種蛋白酶酶解產物對ABTS陽離子自由基清除作用均表現出明顯的量效關系,即隨著酶解產物質量濃度的增加,ABTS陽離子自由基清除能力隨之增強。酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶及木瓜蛋白酶的酶解產物清除ABTS陽離子自由基能力較未處理組均顯著提高(P<0.05),對ABTS陽離子自由基清除作用的IC50值分別為(0.11±0.004)、(0.18±0.01)、(0.49±0.02)、(0.39±0.01)mg/mL,而未處理組的IC50值為(1.66±0.01)mg/mL。臭鱖魚酶解產物ABTS陽離子自由基清除能力的顯著提高,可能與不同蛋白酶酶解產物中可溶性多肽含量的增加有關。有大量研究顯示,多肽類物質能顯著清除ABTS陽離子自由基,具有良好的抗氧化作用[30-32]。
表7 臭鱖魚酶解產物對DPPH自由基的清除作用Table 7 DPPH radical scavenging ability of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish
由表7可知,臭鱖魚的4 種蛋白酶酶解產物均呈現出顯著的DPPH自由基清除作用,并呈現明顯的量效關系。DPPH自由基清除能力從大到小依次為VC>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>堿性蛋白酶>酸性蛋白酶>未處理組,其DPPH自由基清除作用的IC50值分別為(0.04±0.002)、(1.15±0.04)、(2.29±0.08)、(2.41±0.02)、(3.05±0.06)、(3.46±0.10)mg/mL,說明4 種蛋白酶對臭鱖魚魚肉進行蛋白質酶解,可以顯著提高其DPPH自由基清除作用(P<0.05)。
由表8可知,臭鱖魚不同蛋白酶酶解產物均具有較好的還原能力,隨著酶解產物質量濃度的增加,還原能力增強。與未發(fā)酵組相比,臭鱖魚的4 種蛋白酶酶解產物的還原能力顯著提高(P<0.05)。結果表明,4 種蛋白酶酶解產物還原能力的變化規(guī)律與對ABTS陽離子自由基清除能力一致,說明臭鱖魚中可溶性多肽可能是其發(fā)揮抗氧化作用的主要活性物質。
表8 臭鱖魚酶解產物的還原能力Table 8 Reducing powers of enzymatic hydrolysates of stinky mandarin fish
本研究采用高通量測序技術分析發(fā)酵前后鱖魚中菌群組成及變化情況,解析各類微生物的結構比例,明確優(yōu)勢菌群。結果表明,發(fā)酵前鱖魚的主要優(yōu)勢菌為假單胞菌屬、肉桿菌屬、沙雷氏菌屬、漫游球菌屬及冷桿菌屬;而發(fā)酵后臭鱖魚的總細菌群落組成發(fā)生變化,主要由冷桿菌屬、漫游球菌屬、弓形桿菌屬及Psychrilyobacter組成。由于氧氣含量、溫度、鹽濃度、競爭等因素,發(fā)酵后臭鱖魚的優(yōu)勢菌數量逐步增加變得顯著,說明優(yōu)勢菌與臭鱖魚的發(fā)酵品質有密切關系[22],其中冷桿菌屬、漫游球菌屬、乳桿菌屬等為主要優(yōu)勢菌,在臭鱖魚發(fā)酵過程中起重要作用。發(fā)酵后臭鱖魚的營養(yǎng)成分、理化性質及質構特性等發(fā)酵品質發(fā)生了顯著變化,其中灰分、可溶性多肽、可溶性總糖、硬度較發(fā)酵前均顯著增加,而水分、水分活度、粗蛋白明顯減少;發(fā)酵后臭鱖魚魚肉呈現灰白色,魚肉組織結構出現嚴重皺縮,卷曲現象更明顯,魚肉間形成了較為清晰的紋路。相關性分析表明,菌群的種類和豐度對發(fā)酵后臭鱖魚理化指標的影響較大,從而影響產品品質,其中對發(fā)酵后臭鱖魚理化指標影響較大的細菌為漫游球菌屬。
采用酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對發(fā)酵后臭鱖魚肉糜進行蛋白質酶解,并評價4 種不同酶解產物的抗氧化能力。結果發(fā)現,臭鱖魚4 種蛋白酶酶解產物清除ABTS陽離子自由基、DPPH自由基能力及還原能力較未處理組顯著提高,這可能與不同蛋白酶酶解產物中可溶性多肽含量的增加有關。本研究闡明了發(fā)酵前后鱖魚微生物群落組成和品質特性的差異及相關性,揭示了發(fā)酵后臭鱖魚蛋白酶解產物具有良好的抗氧化活性,研究結果為準確認識徽州臭鱖魚的微生物群落結構組成及發(fā)酵品質提供數據參考,為臭鱖魚的微生物與酶協(xié)同發(fā)酵及提高臭鱖魚應用價值提供了可能性。