畢星宇，蘇丹，朱鵬飛，張棟棟，武學(xué)清

(山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030013)

人類生育力是人類繁衍生息、社會文明得以延續(xù)的基本推動力，是推動人類社會進步和經(jīng)濟發(fā)展的基礎(chǔ)保障。隨著惡性腫瘤發(fā)病率逐年增加、發(fā)病年齡逐漸降低以及生育年齡推遲等原因，對生育力保存的需求急劇增加[1]。生育力保存將是未來幾年面臨的重大挑戰(zhàn)。女性生育力保存的主要方法有胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢組織冷凍。胚胎冷凍及卵子冷凍技術(shù)已經(jīng)成熟，應(yīng)用也已經(jīng)非常廣泛。卵巢組織冷凍技術(shù)也在近幾年迅速發(fā)展，越來越多的研究者關(guān)注這項技術(shù)[2-3]，并不斷改進方法，減少凍融操作對卵巢組織的損傷[4-8]。本研究觀察了梯度平衡法對卵巢組織玻璃化保存效果的影響。

材料與方法

一、動物及試劑

1.實驗動物：實驗用豬品系為大白×長白雜交F1代，7月齡，雌性，飼養(yǎng)條件清潔級。實驗動物倫理審批號：IRB-KYYN-2020-001。實驗所用卵巢取自同一品系同月齡的3只豬，取到新鮮豬卵巢后迅速運送至實驗室。將卵巢沖洗干凈，小心將卵巢皮質(zhì)切成2 cm×2 cm×1 mm 大小的組織片備用。

2.主要試劑：平衡液(ES，7.5%乙二醇+7.5%二甲基亞砜)、玻璃化冷凍液(VS，15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.5 mol/L蔗糖)、解凍液(TS，1 mol/L蔗糖)、稀釋液(DS，0.5 mol/L蔗糖)、沖洗液(WS，0.25 mol/L蔗糖)。乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖(Sigma，美國)，GB培養(yǎng)液(COOK，美國)，TUNEL檢測試劑盒(Roche，瑞士)。

二、研究方法

1.實驗分組：根據(jù)樣品處理方法不同分為對照組、梯度平衡組和直接平衡組。對照組為新鮮豬卵巢，梯度平衡組采用梯度平衡法冷凍豬卵巢，直接平衡組采用直接平衡法冷凍豬卵巢。對照組和解凍后的梯度平衡組、直接平衡組卵巢組織均進行切片，HE染色和TUNEL檢測。

2.卵巢組織玻璃化冷凍：(1)直接平衡法：將組織切片洗干凈后置于ES平衡液里25 min。將組織切片轉(zhuǎn)移到VS中放置15 min，期間可觀察到組織切片沉至培養(yǎng)皿底部。將組織切片放置到載桿上迅速投到液氮中保存。(2)梯度平衡法：梯度平衡法是對玻璃化冷凍的第一步平衡條件進行優(yōu)化。具體操作步驟為：組織片置于GB培養(yǎng)液中，先加入等體積ES平衡液，10 min后再加入等體積ES平衡液，10 min后將組織片置于純ES平衡液中。其他步驟與直接平衡法一致。

3.卵巢組織玻璃化解凍：將載桿從液氮中取出并快速投到37℃預(yù)熱的TS液中，將組織片輕輕剝離下來，靜置1 min。將組織片轉(zhuǎn)移到DS液中，靜置3 min。轉(zhuǎn)移到WS液中，靜置5 min。再將組織片轉(zhuǎn)移到新WS液中，靜置5 min。然后將組織置于4%多聚甲醛中備用。

4.卵巢組織切片、HE染色及形態(tài)學(xué)觀察：將組織置于4%多聚甲醛中固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度5 μm，連續(xù)切片，每10張切片選1張做HE染色；每張切片選取5個視野，共選取60個視野，根據(jù)Gouge on標(biāo)準(zhǔn)[9]對卵泡形態(tài)進行觀察計數(shù)。統(tǒng)計每個視野中原始卵泡、初級卵泡正常個數(shù)及總個數(shù)。

5.卵巢組織原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測卵泡凋亡情況：組織切片脫蠟復(fù)水后，蛋白酶K室溫孵育30 min，然后使用TUNEL試劑盒進行檢測，熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。TUNEL陽性凋亡細胞可以觀察到綠色熒光，正常細胞只能觀察到細胞核DAPI藍色熒光。組織切片每隔10張切片選取1張進行染色，染色后每張切片隨機選取5個視野，共選取60個視野進行拍照、計數(shù)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行分析。兩組形態(tài)學(xué)正常卵泡的百分率和凋亡百分率采用χ2檢驗分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組卵巢切片組織形態(tài)學(xué)比較

3組卵巢切片HE染色后鏡下觀察卵泡形態(tài)，對照組卵母細胞胞質(zhì)及細胞核形態(tài)正常，顆粒細胞整齊排列在卵母細胞周圍，梯度平衡組和直接平衡組的卵母細胞胞質(zhì)或細胞核皺縮，顆粒細胞排列松散雜亂甚至缺失(圖1)。

與對照組相比，梯度平衡組和直接平衡組的卵泡正常率均有所下降(均P<0.05)，但是這兩組相比沒有顯著差異(P>0.05)(表1)。

A：對照組；B：梯度平衡組；C：直接平衡組；黑色箭頭示異常卵泡圖1 各組卵巢組織形態(tài)(HE染色 ×200)

表1 各組卵巢組織中卵泡形態(tài)正常率比較(%)

二、各組卵巢細胞凋亡率比較

3組卵巢組織切片TUNEL檢測結(jié)果顯示，各組均有不同程度的細胞凋亡(圖2)。以梯度平衡組為例，對不同類型的細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)卵母細胞、基質(zhì)細胞、顆粒細胞均發(fā)生了凋亡(圖3)。

分別統(tǒng)計3組卵巢基質(zhì)細胞、顆粒細胞、卵母細胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，梯度平衡組與直接平衡組的細胞凋亡率均有顯著增加(P<0.05)，但梯度平衡組相對于直接平衡組卵母細胞、顆粒細胞、基質(zhì)細胞凋亡率(分別為14.8% vs. 17.6%、13.8% vs. 15.2%和15.7% vs. 18.5%)均顯著降低(P<0.05)(表2)。

DAPI：藍色熒光標(biāo)記細胞核；TUNEL：綠色熒光標(biāo)記凋亡細胞；Merge：兩種熒光疊加；scale bar=50 μm圖2 各組卵巢組織TUNEL檢測(×200)

A：基質(zhì)細胞；B：顆粒細胞；C、D：卵母細胞；黃色箭頭示凋亡細胞，白色箭頭示正常細胞；scale bar=50 μm圖3 梯度平衡組中不同類型細胞凋亡觀察(TUNEL染色 ×400)

組 別卵母細胞凋亡率顆粒細胞凋亡率基質(zhì)細胞凋亡率對照組 9.3(18/194)8.5(226/2 659)10.6(355/3 361)梯度平衡組14.8(25/169)*13.8(319/2 312)*15.7(480/3 059)*直接平衡組17.6(30/170)*#15.2(328/2 158)*#18.5(640/3 472)*#

討 論

近年來的生育年齡后延、環(huán)境污染、惡性疾病年輕化等因素，導(dǎo)致人類生育力正在面臨前所未有的威脅。因此，制定生育力保護策略顯得尤為重要。隨著人們的生活質(zhì)量提高和生活方式的改變，腫瘤疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，腫瘤患者保存生殖能力的需求也越來越迫切。

卵母細胞凍存、胚胎凍存、卵巢組織凍存等技術(shù)的發(fā)展為女性生育力保護提供了可行性。卵母細胞凍存及胚胎凍存技術(shù)已經(jīng)成熟，并得到了廣泛應(yīng)用，解凍后存活率及移植妊娠率均在較高水平。但是卵母細胞凍存和胚胎凍存受配偶及性成熟的限制，采用的促排卵治療方案也可能延誤腫瘤患者最佳治療時機。相對于卵母細胞及胚胎冷凍而言，卵巢組織冷凍不受性成熟年齡、生理周期及配偶限制，而且生育力儲備大，不需要刺激卵巢、不耽誤腫瘤治療、不存在誘發(fā)腫瘤惡變的可能[10-11]，所以玻璃化冷凍卵巢組織在腫瘤患者放化療之前的生育力保存[12-14]及卵巢早衰患者的體外激活[15]等方面有廣泛的應(yīng)用前景，適用于無法進行促排卵治療和青春期前的年輕女性患者。目前，已經(jīng)有很多女性通過卵巢組織冷凍保存生育力，解凍移植后成功受孕[16-17]。卵巢組織冷凍雖然可以保存大量的卵泡(主要是原始及初級卵泡)以備患者將來使用[18]，但卵巢中數(shù)以萬計的原始及初級卵泡在經(jīng)過冷凍解凍的過程中會受到損傷，如何減少這一過程中對卵泡造成的損傷，改善凍融效果是目前需要解決的問題。

卵巢組織玻璃化冷凍作為一個新興的技術(shù)，越來越多的受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注，已經(jīng)有研究者從冷凍載體類型、復(fù)溫時間等角度研究優(yōu)化玻璃化凍融效果[4-8]，但是利用梯度平衡法優(yōu)化卵巢組織冷凍效果尚未見文獻報道。本研究首次提出利用梯度平衡法優(yōu)化卵巢組織凍融效果，并在組織形態(tài)學(xué)及細胞凋亡水平對其進行驗證。在玻璃化冷凍中，平衡是非常關(guān)鍵的一步。平衡液中的冷凍保護劑對于細胞而言是一種高滲溶液，卵巢中顆粒細胞及卵母細胞接觸到冷凍保護劑的瞬間會迅速脫水收縮，但隨著冷凍保護劑進入細胞，細胞內(nèi)外滲透壓逐漸一致，顆粒細胞和卵母細胞會恢復(fù)原狀。此過程中，高濃度的冷凍保護劑可能對細胞產(chǎn)生損傷，從而引起細胞凋亡。本文提出一種梯度平衡法，先讓細胞接觸低濃度的冷凍保護劑然后逐漸提高冷凍保護劑的濃度，最終達到細胞內(nèi)外滲透壓的平衡。這樣就可以減緩高濃度冷凍保護劑對細胞的瞬間沖擊，減少細胞凋亡率。卵巢組織冷凍的目的主要是保存卵巢中的原始及初級卵泡，原始及初級卵泡中未成熟的卵母細胞對于環(huán)境的變化極其敏感，我們采用梯度平衡法減少冷凍過程對于細胞的損傷，使凍融的效果更好。

卵巢組織切片HE染色實驗發(fā)現(xiàn)，玻璃化凍融會影響卵巢組織形態(tài)，降低卵泡正常率，但是未發(fā)現(xiàn)梯度平衡法對于卵巢組織玻璃化凍融后形態(tài)學(xué)有改善效果。TUNEL檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于對照組，梯度平衡組和直接平衡組卵母細胞、基質(zhì)細胞、顆粒細胞的凋亡率均顯著增加，說明玻璃化冷凍對卵巢組織不同類型細胞均會造成一定損傷。但是與直接平衡組相比，梯度平衡組卵母細胞、基質(zhì)細胞、顆粒細胞的凋亡率顯著降低，說明梯度平衡法可以降低卵巢組織冷凍過程中造成的細胞凋亡，改善玻璃化凍融的效果。玻璃化凍融對細胞凋亡的影響可能比對卵巢形態(tài)的影響更直接，所以在形態(tài)學(xué)上未反映出梯度平衡法的優(yōu)勢，而在細胞凋亡方面梯度平衡法效果比較顯著。利用梯度平衡法可以有效減少卵巢卵母細胞、基質(zhì)細胞、顆粒細胞的凋亡率，如果應(yīng)用于人類卵巢組織冷凍中，就可以減少復(fù)蘇后的卵巢組織細胞的凋亡。從而使重新移植回患者體內(nèi)的卵巢組織更好的發(fā)育，提高患者獲卵率及卵母細胞質(zhì)量。

我們在本實驗中初步探討了梯度平衡法對于豬卵巢玻璃化凍融后組織形態(tài)學(xué)及卵泡凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)梯度平衡法可以降低豬卵巢凍融后卵泡的凋亡率。此技術(shù)是否可以運用到人類卵巢玻璃化冷凍，對于后續(xù)卵子成熟、受精是否有影響，仍需進一步實驗驗證。卵巢組織玻璃化凍融技術(shù)的不斷優(yōu)化，將會使卵巢組織凍融在女性生育力保存方面有更廣泛的臨床應(yīng)用前景，值得進一步深入研究。