林云碧，雷慶齡，楊春會(huì)，桑寶華

(昆明市兒童醫(yī)院血液科；云南 昆明 650228)

血管性血友病(von Willebrand disease，vWD )是兒童臨床上常見(jiàn)的常染色體遺傳性出血性疾病，是因?yàn)檠苄匝巡∫蜃?von W i ll ebrand factor，VW F )數(shù)量減少或功能異常所導(dǎo)致的遺傳性疾病， 多數(shù)為顯性遺傳，少數(shù)為隱性遺傳，其發(fā)病率約為 1/1000 。臨床表現(xiàn)主要為不同程度的出血，如鼻出血、牙齦出血、皮膚瘀斑，皮膚擦傷后出血，女性的月經(jīng)血量過(guò)多和產(chǎn)后出血，術(shù)后出血等。 尤其是 3 型 vWD嚴(yán)重患者可出現(xiàn)胃腸道出血、關(guān)節(jié)積血。我們對(duì) 2例vW D患者應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序進(jìn)行基因分析診斷，報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料：

病例1：患兒男，7歲，因反復(fù)鼻衄就診，每次發(fā)病出血量大，按壓局部，鼻腔填塞均不能止住，伴嘔血，皮膚瘀斑，面色蒼白，血色素最低到30g/L，無(wú)抽搐，無(wú)關(guān)節(jié)腫痛、肌肉腫痛，平時(shí)出血一般5-7天發(fā)生鼻衄一次，量多。2016年行凝血因子VIII：c濃度為1.3%，診斷為甲型血友病，未預(yù)防治療，遇到出血嚴(yán)重時(shí)予輸注VIII因子（10-20u/kg.次）q8h,效果差，不能改善出血的嚴(yán)重程度及頻率，2017年4月患兒再次鼻衄，伴失血性貧血就診，肝腎功能、電解質(zhì)、血小板數(shù)量均正常，查看患兒既往凝血因子檢查，發(fā)現(xiàn)患兒VWF-Ag0.8%(血型A型)低于正常，VIII：c1.3%,APTT74.5秒，PT13.3秒，其姐有類似病史，VWF-Ag4.6%(血型A 型)低于正常，VIII：c2.4%,APTT60.3秒，PT10.7秒，平時(shí)未給予治療，因消化道嚴(yán)重出血而死亡。家族中有一叔叔、娘娘、舅舅均無(wú)出血病史（未成家）父母及外祖父母均無(wú)出血病史。

病例2：男，2歲，雙胎之大，因反復(fù)鼻衄就診，出血量多，不易止血，伴重度貧血，無(wú)關(guān)節(jié)肌肉腫痛，出血時(shí)間不一定，曾診斷為血友病甲，予補(bǔ)充凝血因子VIII和血漿輸注。肝腎功能正常，血小板數(shù)量正常。凝血時(shí)間APTT,71.6秒VIII：2.3%，VWF-Ag：0.9%，血型BRhD陽(yáng)性，其同胞弟弟有類似病史，VIII：3.7%，VWF-Ag：2.7%，父母均無(wú)出血病史。

1.2 檢驗(yàn)方法：

標(biāo)本送檢北京邁基諾基因科技股份有限公司/北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所。對(duì)DNA序列突變分析，采用高通量測(cè)序技術(shù)，選擇血液系統(tǒng)出血和血栓相關(guān)panel基因檢測(cè)組合，對(duì)患者進(jìn)行基因突變篩查。致病位點(diǎn)判斷方法嚴(yán)格按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）[3]指南進(jìn)行致病性分析，Sanger法測(cè)序驗(yàn)證父母。錄入人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（Human Gene Mutation Database，HGMD）專業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）進(jìn)行檢索，判斷是否為新發(fā)基因突變。

2 結(jié) 果

例1：對(duì)患兒男（姐姐未做）進(jìn)行基因檢查發(fā)現(xiàn)該患兒VWF基因36外顯子c.6085_6091del（P.V2029Ffs*68）純合突變。c.6085_6091del(缺失)，導(dǎo)致氨基酸改變P.V2029Ffs*68為移碼突變。該變異在人群中發(fā)生頻率極低，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，受檢患兒父親該位點(diǎn)雜合變異，受檢患兒母親該位點(diǎn)雜合變異。該位點(diǎn)為疑似致病性變異[1]。

例2：進(jìn)行基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)V W F基因3 6外顯子c.6085_6091delGTCTCTG(P.V2029Ffs*68)純合突變，該變異為零效變異（移碼突變）在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率為-，為低頻變異，經(jīng)家系驗(yàn)證分析，申斌汛父親該位點(diǎn)雜合變異，申斌汛母親該位點(diǎn)雜合變異，申斌汛兄弟該位點(diǎn)純合變異，該變異初步判定為疑似致病性變異（Likelypathogenic）。

附圖：例1：患兒基因信息

基因 染色體位置 外顯子 基因突變 純合突變/雜合突變 突變類型 突變來(lái)源 是否致病VWF chr12-6103745-6103752 36號(hào)外顯子c.6085_6091delGTCTCTG(P.V2029Ffs*68) 純合突變 移碼突變 父母 可疑致病

3 討 論

血管性血友?。╲on Willebrand diesease,vWD）是vWF缺乏或功能異常導(dǎo)致的一種遺傳性出血性疾病。vWD多為常染色體顯性遺傳(AD)，少數(shù)為常染色體隱性遺傳(AR)，根據(jù)VWD發(fā)病機(jī)制與表型分為3個(gè)類型：1 型是指 vWF 含量減少，但功能正常。此型中VWF：Ag和VWF：RCo同步降低，vWF 含量下降，因子 VIII 活性降低，約占所有 VWD 的60%-80%；2 型為 vWF 功能異常，約占 15%-30%，出血較I型重，2型又可分為 2A、2B、2M 和 2N 4 種亞型；其中IIN型為vWF基因與VIII結(jié)合部位突變，導(dǎo)致對(duì)FVIII親和力降低，臨床表現(xiàn)與血友病A相同；3 型為 vWF 數(shù)量完全缺乏，占 5%～10% FVIII水平極低，屬vWF基因異常的純合子或雙重雜合子，突變可發(fā)生在VWF基因各個(gè)區(qū)域。臨床表現(xiàn)出血嚴(yán)重。vWF基因位于12號(hào)染色體短臂頂端（12p13.3）,vWF的cDNA編碼產(chǎn)生一個(gè)2813個(gè)氨基酸組成的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，該前體包含22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，741個(gè)氨基酸的前肽（VWFAg：II）和2050個(gè)氨基酸的成熟單位[2]。vWF基因突變類型包括插入或缺失突變、無(wú)義突變、剪接位點(diǎn)突變、錯(cuò)義突變和啟動(dòng)子突變等，以錯(cuò)義突變最常見(jiàn)。vWD的主要發(fā)病機(jī)制是vWF基因突變，vWF基因檢測(cè)可幫助vWD的分型和鑒別診斷。vWD的診斷中應(yīng)重視提示vWF功能異常的vWF：RCo/vWF：Ag比值和FⅧ：C／vWF：Ag比值[3]。

例1：

例2：

本文對(duì)2例vWD 患者應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲高通量測(cè)序進(jìn)行基因診斷分析，發(fā)現(xiàn)c.6085_6091del(缺失)，導(dǎo)致氨基酸改變P.V2029Ffs*68，為移碼突變。該變異在人群中發(fā)生頻率極低，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)。在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，受檢患兒父親該位點(diǎn)雜合變異，受檢患兒母親該位點(diǎn)雜合變異。 其中例2中兄弟有相同位點(diǎn)的純合突變。該變異在人群中發(fā)生頻率極低，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)。在 HGMD專業(yè)版數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道，為新發(fā)突變，根據(jù) ACMG指南，該變異初步判定為疑似致病性變異（Likelypathogenic）?？蔀榛颊叩倪z傳咨詢、臨床診斷和產(chǎn)前診斷提供準(zhǔn)確依據(jù)。本研究中我們對(duì)臨床診斷的2例vWD患兒采用二代高通量及傳統(tǒng)一代測(cè)序技術(shù)，進(jìn)行表型與基因型分析，發(fā)現(xiàn)了新的基因突變，為此類患兒的診斷和治療提供新的依據(jù)。2例患兒均有家族史，為純合突變，臨床出血嚴(yán)重，VWF：Ag和VIII均明顯下降，其中例1姐姐因消化道大出血，就診不及時(shí)，治療無(wú)效死亡。astaman G報(bào)道多數(shù)3型VwD突變?yōu)樾∑蔚娜笔?、插入及無(wú)義突變，且80%～90%的該型患者為純合突變，3型VWD有嚴(yán)重出血癥狀，往往需要VIII/VWF替換治療。因此2例患兒多考慮為3型，可通過(guò)行VWF-FVIII結(jié)合實(shí)驗(yàn)及VWF：Rco測(cè)定進(jìn)一步確定類型。