王興群 ，毛以智，張 繼，吳 雪，邱淦遠(yuǎn)，劉鵬程，楊茂林，劉若余*

（1.遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州遵義 563000；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽 550025；3.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025；4.貴州省江口縣科技局，貴州銅仁 554400）

很多研究表明肌纖維的類型與pH、肉色、嫩度等肉質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)，是影響畜禽肉品質(zhì)的一個重要因素[1-2]。根據(jù)顏色、收縮特性和生理生化特征，肌纖維可以劃分為2 類：Ⅰ型（紅肌）肌纖維，是慢速氧化型肌纖維；Ⅱ型肌纖維，分為快速氧化型（Ⅱa 型）、快速酵解型（Ⅱb型）和中間型（ⅡX 型）[3-4]，分別對應(yīng)MyHC基因的4 種亞型[5]。Ⅰ型肌纖維直徑小，肌紅蛋白和血紅蛋白含量高，Ⅰ型肌纖維含量高則肌肉顏色鮮紅，肉色評分高，剪切力小，肉質(zhì)細(xì)嫩，口感較好[6]；Ⅱ型肌纖維直徑大，剪切力大，含量高會使肌肉顏色蒼白，糖酵解產(chǎn)生的乳酸使pH 下降加快，影響肌肉的系水力，總體肉質(zhì)口感較差[7]。動物在出生后肌纖維數(shù)量不再變化，但是在動物整個發(fā)育時期均存在肌纖維的轉(zhuǎn)化[8]。

近年來已有很多研究證明鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN 或CN）是調(diào)節(jié)肌纖維轉(zhuǎn)化的一種重要信號分子[9]。CaN 是由調(diào)節(jié)亞基（CnB）和催化亞基（CnA）兩部分構(gòu)成的蛋白二聚體[10]。PPP3CA基因編碼CnB 的一個亞型，主要存在于骨骼肌中[11]，已有研究證明CaN 對肌纖維類型的轉(zhuǎn)化起著關(guān)鍵性作用[9.12]，可以使C2C12肌細(xì)胞Ⅰ型肌纖維基因上調(diào)，并將Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化為Ⅰ型肌纖維[13]，但PPP3CA在畜禽上的研究鮮見報道。

江口蘿卜豬是貴州特色豬種之一，具有易飼養(yǎng)、肉質(zhì)好等優(yōu)點[14-15]，但是又有瘦肉率低、生長緩慢等缺點[16]。本研究選擇PPP3CA基因為候選基因，以江口蘿卜豬為研究對象，擴增了PPP3CA基因全部外顯子和啟動子序列，以直接測序的方式篩選SNPs 位點，并測定了11項主要肉質(zhì)指標(biāo)，研究PPP3CA基因SNPs 與江口蘿卜豬肉質(zhì)性能之間的關(guān)系，期望篩選到影響江口蘿卜豬肉質(zhì)性能的重要功能SNPs，為江口蘿卜豬的分子選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物為112 頭成年江口蘿卜豬，均為10～12 月齡，屠宰前平均體重為70～80 kg。屠宰后立即取部分背最長肌和腰大肌用于測定pH、肉色、熟肉率、失水率、剪切力等11 項肉質(zhì)性能指標(biāo)，另取少量組織于預(yù)裝75%酒精的EP 管中保存，用于提取DNA。樣品均采自貴州省銅仁市江口縣江口蘿卜豬繁育中心。

1.2 主要儀器與試劑 數(shù)顯肌肉嫩度測定儀（C-LM3B，北京天翔飛域科技有限公司）、胴體pH 測定儀（PHSTAR，德國，Matthaus 公司）、胴體肉色測定儀（OPTO-STAR，德國，Matthaus 公司）、肉質(zhì)品質(zhì)分析儀（series3000，澳大利亞，Next Instruments 公司）、Ezup 柱式動物基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）、瓊脂糖（Agrose，上海生工生物工程有限公司）、2×Taq MasterMix（康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.3 DNA 提取和肉品質(zhì)測定 利用DNA 抽提試劑盒提取江口蘿卜豬背最長肌中的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計分別檢測DNA 完整性、濃度以及純度。將檢測結(jié)果良好的DNA 樣本濃度調(diào)整至50 ng/μL，然后每個樣本取10 μL 混合于離心管中備用。肉質(zhì)測定中，大理石紋、剪切力、滴水損失、熟肉率等指標(biāo)參照《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 821-2004）測定；屠宰后1 h 和24 h 的pH 用胴體pH測定儀測定；肉色用胴體肉色測定儀測定，以O(shè)pto 值表示，Opto 值參考標(biāo)準(zhǔn)：Opto ≥63 為優(yōu)，即肉品質(zhì)好；53 ≤Opto＜63 為良，即較滿意；Opto ≤53 為差，即肉品質(zhì)有缺陷（PSE 肉）[17]。肌內(nèi)脂肪含量、水分和粗蛋白用肉品質(zhì)分析儀測定，測定之前用索氏抽提法測定5 個樣本數(shù)據(jù)輸入肉品質(zhì)分析儀中建立函數(shù)曲線，矯正誤差。

1.4 引物設(shè)計與PCR 擴增 根據(jù)NCBI 上豬PPPCA基因DNA 參考序列（登錄號：NC_010450.4）設(shè)計16 對特異性引物送由上海生工生物工程有限公司合成，用于擴增PPPCA基因全部14 個外顯子和啟動子序列。引物序列見表1。PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq PCR Master Mix 5 μL，10 pmol/μL 上、下游引物各0.8 μL，DNA 模板1.4 μL，最后加ddH2O 補足10 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72℃延伸5 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增效果，將檢測合格的樣本送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

表1 PPP3CA 基因引物序列

1.5 生物信息學(xué)分析 由于不同的生物信息學(xué)分析預(yù)測軟件采用的數(shù)學(xué)模型和算法不盡相同，預(yù)測結(jié)果也有一定的差異，為盡可能提高預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究盡量采用多種預(yù)測軟件同時預(yù)測，然后再分析比對結(jié)果，具體網(wǎng)址見表2。

1.6 統(tǒng)計分析 用SeqMan 查看擴增得到的外顯子和啟動子片段的測序結(jié)果，與參考序列進(jìn)行比對和分析篩選套峰位點，初步確定SNPs 位點。再用單個樣本DNA為模板擴增SNPs 位點對應(yīng)外顯子或啟動子并測序，以驗證混池測序篩選到的SNPs 位點和進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計不同基因型個體數(shù)量?；蚣兒隙龋℉o）、基因雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）以及Hardy-Weinberg 平衡的χ2值等群體遺傳參數(shù)利用Pop Gene32 軟件計算。運用SHEsis（http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）在線軟件進(jìn)行連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析。計算不同基因型江口蘿卜豬各項肉質(zhì)指標(biāo)的平均值，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 18.0 軟件單因素方差分析對不同基因型個體肉品質(zhì)性狀指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴增 由圖1 可知，產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮、無雜帶、無彌散和拖尾，說明PCR 擴增條件合適，引物特異性好，片段大小與目的片段大小一致，可用于后續(xù)研究。

2.2 PCR 測序分型 將擴增得到的江口蘿卜豬PPP3CA基因全部外顯子和啟動子片段進(jìn)行雙向測序，經(jīng)比對分析，共發(fā)現(xiàn)3 個SNPs 位點。按照SNPs 位點的一般命名規(guī)則，將豬PPP3R1基因參考序列第1 外顯子第1 位堿基定義為+1，則這3 個位點分別為A-918C、G154767A 和G316451A，其中A-918C 位于啟動子區(qū)，G154767A 和G316451A 分別位于第2 外顯子和第12外顯子，均為同義突變。分別以每個樣本DNA 為模板擴增多態(tài)位點對應(yīng)的外顯子和啟動子序列，測序驗證多態(tài)位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 個位點均為3 種基因型（圖2）。

2.3 群體遺傳參數(shù)分析 由表3 可知，A-918C 位點等位基因分布較均勻；而G154767A 和G316451A 位點等位基因頻率差異大，GG 為優(yōu)勢基因型，G 為優(yōu)勢等位基因，等位基因頻率分別為0.772 7 和0.767 9，表明群體內(nèi)變異程度較低，等位基因分布不均勻。3 個位點PIC 均為中度多態(tài)，可以提供一定的遺傳信息。χ2檢驗顯示A-918C 位點和G316451A 位點處于Hardy-Weinberg 平衡，G154767A 位點極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，表明該位點可能存在選擇或遺傳漂變。

2.4 單倍型、雙倍型分析以及連鎖不平衡分析 對檢測到的3 個SNPs 位點進(jìn)行連鎖不平衡分析。根據(jù)D’值和r2判斷位點之間是否存在連鎖，其中D’=1 為完全連鎖，D’=0 為無連鎖或連鎖平衡，r2=1 為完美連鎖，r2＞0.33 提示為強連鎖，r2=0 為無連鎖或連鎖平衡。由圖3 可知，3 個位點之間無強連鎖不平衡。單倍型和雙倍型分析結(jié)果見表4，舍去頻率低于0.03 的單倍型和雙倍型，共有7 種單倍型和8 種雙倍型，其中H3（AGG）為頻率最高的單倍型，H3H3 為頻率最高的雙倍型。

2.5 生物信息學(xué)分析

2.5.1 mRNA 二級結(jié)構(gòu)分析 本研究發(fā)現(xiàn)的3 個位點中G154767A 和G316451A 位點位于基因外顯子上，因此可能會改變基因編碼mRNA 的核苷酸序列，位點變異前后mRNA 的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象和最小自由能預(yù)測結(jié)果如圖4?？梢钥吹?，G316451A 位點對PPP3CA基因編碼的mRNA 二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象和最小自由能均無影響；G154767A 位點對mRNA 二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象無影響，但會使二級結(jié)構(gòu)最小自由能降低，推測會使mRNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。

表2 生物信息學(xué)分析軟件

圖1 UCP2 基因的PCR 擴增電泳圖

圖2 SNPs 位點不同基因型測序圖譜

表3 PPP3CA 基因群體遺傳參數(shù)

圖3 PPP3CA 基因D’值和r2 值連鎖圖

表4 PPP3CA 基因單倍型與雙倍型分析

2.5.2 核心啟動子區(qū)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點及CpG 島預(yù)測PPP3CA基因調(diào)控序列的核心啟動子區(qū)預(yù)測結(jié)果如表5，2 種軟件分別預(yù)測到2 個可能的核心啟動子區(qū)，A-918C位點位于Promoter2.0 預(yù)測到的一個核心啟動子區(qū)附近，且該處預(yù)測結(jié)果評分較高，說明A-918C 位點的變異可能會對PPP3CA基因啟動子的功能產(chǎn)生影響。采用2 種軟件預(yù)測A-918C 位點變異前后PPP3CA基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點（表6），2 種軟件預(yù)測結(jié)果基本一致，A-918C 位點變異會導(dǎo)致2 個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的消失和2 個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點總數(shù)不改變。采用3 種軟件進(jìn)行啟動子區(qū)CpG 島預(yù)測（表7），3 種軟件均在PPP3CA基因啟動子區(qū)預(yù)測到了不同大小的CpG 島，但A-918C 位點均不在預(yù)測到的CpG 島內(nèi)，說明該位點影響啟動子區(qū)甲基化水平的可能較小。

圖4 PPP3CA 基因mRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

表5 核心啟動子區(qū)預(yù)測結(jié)果

表6 啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果

表7 啟動子區(qū)CpG 島預(yù)測結(jié)果

2.6 SNPs 和雙倍型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性分析 由表8可知，3 個SNPs 位點對應(yīng)的11 項肉質(zhì)指標(biāo)中，除G316451A 位點GG 型和GA 型的大理石紋評分顯著高于AA 型外，其余位點不同基因型之間各個指標(biāo)差異均不顯著。但A-918C 位點AA 和AC 型的個體的肉色和剪切力均明顯高于CC 型個體，而剪切力則反之，不同基因型之間肉色差異接近顯著水平，P值為0.07，這說明AA 和AC 型豬肉質(zhì)在色澤、嫩度等方面一定程度上優(yōu)于CC 型豬。由表9 可知，H6H7（CC-GG-GA）和H7H7（CC-GG-GG）肉色顯著低于其余雙倍型，剪切力明顯高于其余雙倍型（P＞0.05）。

3 討 論

畜禽的生長性能、產(chǎn)肉性能以及肉質(zhì)性能關(guān)乎養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益，而肌纖維的類型對肉質(zhì)性能有著重大的影響。CaN 促進(jìn)Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化為Ⅰ型肌纖維的功能，暗示CaN 可能對豬肉品質(zhì)存在很強的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)了3 個SNPs 位點，每個位點均檢測到了3 種基因型。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)3 個位點之間不存在強連鎖，表明3 個位點趨于獨立遺傳。單倍型分析共發(fā)現(xiàn)7種單倍型并可以組合為8 種雙倍型，其中H3（AGG）為頻率最高的單倍型，H3H3 為頻率最高的雙倍型。位于外顯子上的G154767A 和G316451A 位點等位基因頻率差異大，等位基因分布不均勻，表明群體內(nèi)變異程度較低。G154767A 位點會使mRNA 二級結(jié)構(gòu)最小自由能降低，穩(wěn)定性降低，實驗群體中GA 和AA 型個體明顯少于GG 型，極顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡，推測可能是存在人工選擇或群體內(nèi)發(fā)生了遺傳漂變。G316451A 位點GG 型和GA 型大理石紋評分顯著高于AA 型，與之對應(yīng)的肌內(nèi)脂肪含量雖也為GG 型和GA型高于AA 型，但無較大差異，這可能是因為大理石紋評分為人工讀數(shù)，造成的誤差較大。但是也有研究者認(rèn)為，肌纖維類型對畜禽肌內(nèi)脂肪含量也存在明顯影響，肌肉內(nèi)脂類含量和分布與肌纖維類型有關(guān)，紅肌纖維具有較強的代謝和貯脂能力，肌內(nèi)脂肪含量和Ⅰ型肌纖維含量成正比[21]，但這種說法還存在一定的爭議，所以PPP3CA基因G316451A 位點對肌內(nèi)脂肪含量是否存在影響還有待進(jìn)一步驗證。位于啟動子上的A-918C 位點等位基因分布較均勻，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)A-918C 位點位于Promoter2.0 預(yù)測到的一個高評分核心啟動子區(qū)附近，還會導(dǎo)致2 個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的消失和2 個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的產(chǎn)生，推測其可能對PPP3CA基因的表達(dá)產(chǎn)生一定影響。與肉質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)A-918C位點AA 和AC 型的個體肉色明顯高于CC 型個體，且差異接近于顯著水平，而剪切力則反之，說明AA 和AC 型豬在色澤、嫩度等方面一定程度上優(yōu)于CC 型豬。此外，雙倍型分析發(fā)現(xiàn)H6H7（CC-GG-GA）和H7H7（CC-GG-GG）肉色顯著低于其余雙倍型，剪切力明顯高于其余雙倍型，且從SNPs 位點不同基因型與肉質(zhì)之間關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果來看，G154767A 位點對各項肉質(zhì)指標(biāo)不存在顯著影響，G316451A 位點僅突變型（AA）大理石紋評分顯著低于其余基因型，而H6H7 和H7H7在G316451A 位點上均不是突變型，與其余雙倍型比較，不難看出，造成H6H7 和H7H7 肉色顯著低于其余雙倍型的原因極有可能是因為A-918C 位點均為突變型（CC），也從側(cè)面說明了A-918C 位點對肉質(zhì)性能有明顯影響。本研究結(jié)果與包艷波[18]發(fā)現(xiàn)PPP3CA基因上的SNPs 對大骨雞肉質(zhì)存在顯著影響的結(jié)果類似，且與秦寧[19]發(fā)現(xiàn)的肌纖維類型主要對pH、肉色和剪切力等指標(biāo)產(chǎn)生影響的結(jié)果相符，印證了PPP3CA基因在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用，也證明了A-918C 位點可能是影響江口蘿卜豬肉質(zhì)性能的重要SNP 位點。

表8 PPP3CA 基因不同基因型個體的肉質(zhì)差異

表9 不同雙倍型個體肉質(zhì)差異

4 結(jié) 論

本研究在江口蘿卜豬PPP3CA基因上發(fā)現(xiàn)了3 個SNPs，分別為A-918C、G154767A 和G316451A。雙倍型分析發(fā)現(xiàn)H6H7（CC-GG-GA）和H7H7（CC-GGGG）肉色顯著低于其余雙倍型，剪切力明顯高于其余雙倍型；G316451A 位點GG 型和GA 型大理石紋評分顯著高于AA 型。