渠景連 趙惠亮 楊邯捷 郭永勝

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽(yáng)550025）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的好發(fā)于中老年人群的以刺激性干咳和進(jìn)行性呼吸困難為主要癥狀的慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺疾病，其肺功能提示限制性通氣功能障礙及彌散功能下降，由于缺乏有效的治療方法，很多患者在確診后3至5年內(nèi)死亡[1-3]。隨著人口老齡化，該病發(fā)病率越來(lái)越高，嚴(yán)重威脅人類健康和生命，因此尋求有效的治療方法是當(dāng)前面臨的一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的課題。有研究表明，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）是IPF發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，在這一過(guò)程中，包括Dll4/Notch4等在內(nèi)的Notch信號(hào)通路參與了EndMT[4-5]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》中補(bǔ)氣活血通絡(luò)的經(jīng)典名方，被廣泛用于IPF的治療，且取得了較好的療效[6-7]。課題組前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)干預(yù)EndMT來(lái)防治IPF[8]，我們推測(cè)這一過(guò)程與調(diào)控Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。因此，本研究基于血清藥理學(xué)方法，觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞Dll4/Notch4信號(hào)的影響，以期進(jìn)一步闡明該方防治IPF的作用機(jī)制，為臨床防治本病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 黃芪、當(dāng)歸、赤芍、地龍、川芎、桃仁、西紅花均購(gòu)自貴陽(yáng)同仁堂藥房，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為正品。

1.2 動(dòng)物 健康8周齡新西蘭兔10只，體重2～2.5 kg，由儀征安立卯生物科技有限公司提供，許可證號(hào)SYXK（蘇）2016-0005。

1.3 細(xì)胞株 HPAEC細(xì)胞，由廣州吉妮歐生物科技有限公司提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4 主要試劑與儀器 TGF-β1（美國(guó)Peprotech公 司，批 號(hào)041316-1）；RPMI-1640培 養(yǎng) 基，胎牛血清，青霉素/鏈霉素，胰酶（美國(guó)Hyclone公司，批 號(hào) 分 別 為AC135526825、AC105264991、AC101511834、AC114002159）；DAPT（美國(guó)MCE公司，批號(hào)11982）；Trizol試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR?Premix Ex Taq（日本Takara公司，批號(hào)分別為AI80403A、RR047A、RR820A）；Notch4抗體、Dll4抗體、CBF1抗體、NICD4抗體（英國(guó)abcam公 司，批 號(hào) 分 別 為GR288351-4、GR162316-12、GR3180240-6、GR288351-4）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)HH0607）；山羊抗兔辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗、兔抗山羊HRP標(biāo)記二抗、山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)分別為3825j63、34q9532、1292k61）；RIPA蛋 白 裂 解 液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為P0013B、P0011）；PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，批號(hào)為R8DA5001）；免疫共沉淀（Co-IP）試劑盒（美國(guó)pierce公司，批號(hào)SG251012）。

BSC-03IIA2-SE型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Ts2R型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公 司）；3131型CO2培 養(yǎng) 箱，Multiskan 51119000型酶標(biāo)儀，NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)（美國(guó)ThermoFisher公司）；Stepone plus熒光定量PCR儀，Veriti PCR熱循環(huán)儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；SDS-PAGE電泳儀，濕法轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Tanon 5200化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 含藥血清制備 結(jié)合人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量表（1.5 kg家兔體表面積為70 kg人的0.07倍），根據(jù)人的用藥量（黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，桃仁3 g，紅花3 g）計(jì)算家兔等效劑量，得到補(bǔ)陽(yáng)還五湯的家兔等效劑量為6.67 g/（kg·d）。結(jié)合動(dòng)物數(shù)量及實(shí)驗(yàn)中的損失，估算出所需總藥量，一次煎煮出所需藥液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＝】敌挛魈m兔適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為補(bǔ)陽(yáng)還五湯組和空白對(duì)照組。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組灌胃給予家兔等效劑量8倍的藥物[53.36 g/（kg·d）]，空白對(duì)照組給予等容積生理鹽水，連續(xù)給藥3 d。末次給藥1 h后麻醉狀態(tài)下頸動(dòng)脈取血，常溫下分離血清，56 ℃水浴滅活，0.22 μm過(guò)濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 EndMT模型制備 將HPAEC細(xì)胞種于六孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合度時(shí)，去除完全培養(yǎng)基，加入0.5% FBS的1640培養(yǎng)基同步24 h，使細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)周期，然后加TGF-β1（5 mg/L）刺激細(xì)胞72 h后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)由鋪路石樣向梭形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞間連接減少，且細(xì)胞間隙變大時(shí)，提示EndMT發(fā)生，細(xì)胞模型制備成功。

2.3 分組 實(shí)驗(yàn)分為空白組（10%空白血清）、模型組（10%空白血清+TGF-β1）、DAPT組（10%空白血清+DAPT+TGF-β1）、10%含藥血清組（10%含藥血清+TGF-β1）、5%含藥血清組（5%含藥血清+5%空白血清+TGF-β1）和2.5%含藥血清組（2.5%含藥血清+7.5%空白血清+TGF-β1）。其中TGF-β1濃度均為5 mg/L，DAPT濃度為0.5 μmol/L。

2.4 RT-PCR試驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h后，按上述方法造模、給藥，培養(yǎng)72 h后收集細(xì) 胞，用Trizol法 提 取 細(xì) 胞 總RNA。Nanodrop檢測(cè)濃度，RNA純度根據(jù)Nanodrop檢測(cè)的濃度和OD230、OD260、OD280決 定。 參 照 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司設(shè)計(jì)合成。Notch4上游引物：5'-AGTGGTGTGAGGTGGAGATA-3'，Notch4下 游 引物：5'-GGGCAGTGGCAGATGAAA-3'；Dll4上 游 引物：5'-ACGAATGCATCCCCCACAAT-3'，Dll4下游引物：5'-ACAGGTGCAGGTGTAGCTTC-3'；CBF1上游 引 物：5'-TCATGCCAGTTCACAGCAGT-3'，CBF1下 游 引 物：5'-GGAGTGCCATGCCAGTAACT-3'；GAPDH上 游 引 物：5'-CAGGGCTGCTTTTAACTCT GGTAA-3'，GAPDH下 游 引 物：5'-GGGTGGAATCA TATTGGAACATGT-3'。PCR反 應(yīng) 體 系：cDNA模板2 μL，SYBR Green solution 10 μL， 上 游 引物（10 μmol/L）0.4 μL，下游 引物（10 μmol/L）0.4 μL，無(wú)菌雙蒸水7.2 μL，配制成20 μL的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)體系。反應(yīng)條件：酶激活95 ℃，10 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸1 min，采集熒光信息，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；95 ℃，10 s，溶解曲線60～95 ℃，采集Tm值信息，可以通過(guò)Tm值是否單一判斷產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增。使用軟件分析PCR過(guò)程中各檢測(cè)樣本的Ct值，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.5 Western blot試驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h后，按上述方法造模、給藥，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑，4 ℃裂解15 min，13 500 g離心15 min，收集上清液，取少量進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)所測(cè)濃度加入上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，保存于-20 ℃待用。配制分離膠和濃縮膠，將已加入上樣緩沖液的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品及待測(cè)樣品加入樣品槽內(nèi)，100 V恒壓電泳約60 min，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部，關(guān)閉電源。100 V，60 min，4 ℃轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫輕搖封閉60 min。將一抗用含5% BSA的TBST溶液按照1∶1000稀釋，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min。將二抗用TBST按照1∶5000稀釋，室溫下孵育2 h，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，每次10 min。Tanon凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件進(jìn)行圖片分析。

2.6 免疫共沉淀（Co-IP）試驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)同步化培養(yǎng)24 h后，按上述方法造模、給藥，培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，提取蛋白樣本，每個(gè)試驗(yàn)樣本體積為500 μL，每個(gè)樣本留取30 μL作為試驗(yàn)input。準(zhǔn)備protein A/G beads，每500 μL蛋 白 樣 品 液 加 入500 μL protein A/G beads，4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)10 min，以去除和bead非特異性結(jié)合的蛋白，降低背景，4 ℃、5000 g離心30 s，將上清轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管中，去除protein A/G beads。每孔加入5 μg抗體，4 ℃，垂直旋轉(zhuǎn)混勻緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。加入50 μL的protein A/G beads（含50%濃度）到每個(gè)蛋白樣品液中，4 ℃緩慢搖動(dòng)4～6 h，使beads與抗體進(jìn)行結(jié)合。4 ℃、5000 g離心30 s，收集bead-抗原抗體復(fù)合物，棄上清，用預(yù)冷的wash buffer洗3次，1 mL/次，每次4 ℃緩慢垂直旋轉(zhuǎn)15 min。用50 μL的2×上樣緩沖液將bead-抗原抗體復(fù)合體重懸，輕輕混勻，100 ℃煮10 min，以分離抗原、抗體和bead，常 溫13 000 g離 心1 min，收 集 上 清，IP和input樣 本 進(jìn) 行SDS-PAGE電泳。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表1。

3.2 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2，圖1。

3.3 各組HPAEC細(xì)胞NICD4與CBF1結(jié)合情況比較 由Co-IP結(jié)果可知，NICD4和CBF1有結(jié)合作用，TGF-β1能促進(jìn)二者的結(jié)合，提示EndMT發(fā)生時(shí)Dll4/Notch4信號(hào)被激活，而阻斷Notch信號(hào)通路后NICD4和CBF1結(jié)合被抑制，補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清能抑制NICD4和CBF1結(jié)合，且隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清濃度增加，NICD4和CBF1結(jié)合作用降低。見(jiàn)圖2。

表1 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達(dá)比較（）

表1 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA表達(dá)比較（）

注： 與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01 ；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與DAPT組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 樣本數(shù) Notch4 mRNA Dll4 mRNA CBF1 mRNA空白組 3 1.000±0.026 1.000±0.036 1.000±0.038模型組 3 1.696±0.090** 1.676±0.036** 2.187±0.039**DAPT組 3 1.032±0.147## 1.167±0.031*## 1.486±0.070**##2.5%含藥血清組 3 1.514±0.004**#△△ 1.266±0.025**#△△ 1.797±0.059**##△△5%含藥血清組 3 1.456±0.048**#△△ 1.401±0.094**##△△ 1.734±0.110**##△10%含藥血清組 3 1.277±0.114##△ 1.192±0.032**## 1.447±0.087**##

表2 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達(dá)比較（）

表2 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1蛋白表達(dá)比較（）

注： 與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01 ；與DAPT組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 樣本數(shù) Notch4/GAPDH Dll4/GAPDH CBF1/GAPDH空白組 3 0.196±0.066 0.187±0.022 0.085±0.020模型組 3 0.543±0.081** 0.618±0.075** 0.451±0.017**DAPT組 3 0.097±0.010## 0.285±0.087## 0.245±0.033**##2.5%含藥血清組 3 0.505±0.093**△△ 0.587±0.096**△△ 0.444±0.008**△△5%含藥血清組 3 0.372±0.056**##△△ 0.443±0.057**#△ 0.299±0.034**##△10%含藥血清組 3 0.283±0.057##△△ 0.341±0.091*## 0.205±0.024**##

圖1 各組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4、CBF1蛋白表達(dá)

圖2 各組HPAEC細(xì)胞NICD4與CBF1結(jié)合情況

4 討論

IPF是最常見(jiàn)、最具侵襲性的肺泡疾病，正常的肺泡結(jié)構(gòu)逐漸消失，進(jìn)而被纖維化組織所取代，其主要特征是成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積。如前所述，EndMT是肺部發(fā)生纖維化的機(jī)制之一，即內(nèi)皮細(xì)胞在各種刺激因素的作用下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。TGF-β1是調(diào)控纖維化EndMT的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)EndMT的發(fā)生，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞可以通過(guò)EndMT而形成肺成纖維細(xì)胞[9]。因此本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)HPAEC細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化建立EndMT細(xì)胞模型。

Notch信號(hào)通路是在進(jìn)化上高度保守的單次跨膜信號(hào)受體蛋白家族，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)由Notch受體（Notch1-Notch4）、Notch配體（Dll1、Dll3、Dll4，Jagged 1和Jagged 2）和轉(zhuǎn)錄因子CBF1/RBP-Jκ組成[10]。Notch配體和特定受體的結(jié)合激活Notch信號(hào)，Notch蛋白經(jīng)過(guò)γ-secretase剪切釋放其胞內(nèi)段NICD，此為Notch受體的活性形式，NICD進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子CBF1/RBP-Jκ結(jié)合，進(jìn)而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]，使用γ-secretase抑制劑DAPT可抑制Notch信號(hào)通路的激活。內(nèi)皮細(xì)胞中激活的Notch信號(hào)可導(dǎo)致形態(tài)學(xué)、表型和功能改變，并誘導(dǎo)EndMT發(fā)生[12-13]。Notch4受體作為Notch家族的一員，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，Dll4也主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，是一種重要的血管生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與鄰近細(xì)胞上的Notch1、Notch4等受體結(jié)合而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，從而影響細(xì)胞增殖、遷移，參與血管重塑[14]。在成人期的血管環(huán)境中，Dll4下調(diào)了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移能力，阻礙了血管發(fā)生[15]。CBF1是Notch4信號(hào)通路的下游信號(hào)分子，也是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與Dll4/Notch4信號(hào)的激活。我們前期研究表明，當(dāng)大鼠發(fā)生肺纖維化時(shí)，Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)被激活[16]，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，HPAEC細(xì)胞的Notch4、Dll4和CBF1的mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，且Notch4的活性形式NICD4與CBF1有結(jié)合作用，說(shuō)明EndMT發(fā)生時(shí)Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)激活，而使用DAPT干預(yù)后可抑制Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)激活，Dll4/Notch4信號(hào)的激活抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，這可能加劇了間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

IPF是一種以咳嗽、氣短、乏力等為主癥的難治性疾病，發(fā)病多因肺氣虧虛、肺絡(luò)瘀滯，在病變發(fā)展過(guò)程中，二者又相互影響。肺氣虧虛，無(wú)力布津行血，則血行緩慢，停留而為瘀，進(jìn)而阻滯肺絡(luò)；肺絡(luò)瘀滯，治節(jié)無(wú)權(quán)則氣血津液難以上行養(yǎng)肺，以致肺體失養(yǎng)，氣機(jī)不利，甚至瘀久生毒，肺氣受損更為嚴(yán)重[8]?？偠灾翁摻j(luò)阻是本病的主要病機(jī)，治療當(dāng)益氣活血通絡(luò)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是益氣活血通絡(luò)的經(jīng)典名方，方中重用補(bǔ)氣藥，并配以少量活血通絡(luò)之品，使氣旺血行以治本，瘀消絡(luò)通以治標(biāo)，標(biāo)本兼顧。本研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞的Notch4、Dll4和CBF1的mRNA及蛋白表達(dá)，且可以抑制NICD4與CBF1的結(jié)合，可見(jiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯干預(yù)EndMT防治肺纖維化的作用機(jī)制與調(diào)控Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，但其具體靶點(diǎn)和機(jī)制還有待后續(xù)進(jìn)一步確認(rèn)。此外，本研究結(jié)果還顯示，2.5%、5%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清組HPAEC細(xì)胞Notch4、Dll4和CBF1 mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于DAPT組，而10%含藥血清組除Notch4 mRNA及蛋白表達(dá)顯著高于DAPT組外，Dll4和CBF1 mRNA及蛋白表達(dá)與DAPT組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清和DAPT均能抑制NICD4和CBF1結(jié)合，隨著補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清濃度增加，NICD4和CBF1結(jié)合作用降低。提示10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清調(diào)控Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)干預(yù)EndMT的作用與DAPT相當(dāng)，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯還具有多靶點(diǎn)、多途徑的調(diào)控作用，在IPF的防治中顯示出越來(lái)越多的優(yōu)勢(shì)。由于本研究只觀察了Dll4/Notch4信號(hào)傳導(dǎo)，是否還和其他信號(hào)通路存在交叉作用，將是我們下一步研究的方向。