張健 李玉梅 何志軍 陳亮 王佩 梁俊 明月

結(jié)直腸癌的發(fā)生受遺傳、環(huán)境等多因素影響，是從正常黏膜-腺瘤-癌的演變過(guò)程[1-2]。miR-21可調(diào)節(jié)下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9的表達(dá)[3]，在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高。VEGF在腫瘤組織中呈高表達(dá)狀況[4]，具有很強(qiáng)的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂增生的能力。MMP-9的高表達(dá)可促使腫瘤組織微血管、微淋巴管的生成，其與VEGF可發(fā)揮協(xié)同作用，從而促使惡性腫瘤擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的發(fā)生[5]。本研究探討結(jié)直腸癌病人miR-21、VEGF、MMP-9的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2013年12月～2016年6月我院收治的結(jié)直腸癌病人144例。男84例，女60例；年齡≥60歲 104例，<60歲40例；腫瘤直徑>4 cm 78例，≤4 cm 66例；分化程度：高分化32例，低分化78例，中分化34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；臨床分期：Ⅰ期74例，Ⅱa期70例。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查確診為結(jié)直腸癌；年齡30～75歲，臨床分期為Ⅰ～Ⅱa期，具有手術(shù)指征，術(shù)前無(wú)放化療治療史；病人臨床資料完整。病人愿意參加本研究。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)直腸癌晚期出現(xiàn)心、肝、腎等多器官損傷；過(guò)敏體質(zhì)、皮膚易出血；伴急性腸梗阻、穿孔等并發(fā)癥；臨床資料缺乏；妊娠或哺乳期婦女及女性育齡病人。

二、方法

1.手術(shù)方法：所有病人均給予腔鏡下根治手術(shù)。氣管插管，建立氣腹，維持氣腹壓力在13～15 mmHg。進(jìn)鏡觀察腫瘤的位置與性質(zhì)。根據(jù)腫瘤的位置與性質(zhì)采用相應(yīng)的手術(shù)方式，結(jié)扎腫瘤所在部位的血管，清除脂肪淋巴組織。術(shù)后均選擇對(duì)應(yīng)的吻合方式，對(duì)腹腔進(jìn)行充分沖洗，留置引流管，逐層關(guān)腹。

2 miR-21、VEGF、MMP-9的檢測(cè)：腫瘤組織為病人腫瘤組織織新鮮標(biāo)本；非腫瘤組織為正常腸黏膜(距癌組織≥5 cm)新鮮標(biāo)本。兔抗人VEGF多抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司(稀釋濃度為1∶500)；鼠抗人MMP-9單抗(稀釋濃度1∶200)均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照，已知的結(jié)直腸癌組織作陽(yáng)性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書(shū)操作。VEGF、MMP-9細(xì)胞核棕褐色3分，棕黃色2分，淺黃色1分，無(wú)染色0分，陽(yáng)性細(xì)胞百分比≤5%為0，6%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4，乘積≥4分為表達(dá)陽(yáng)性。同時(shí)提取組織的總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA按SYBR Green Supermix說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光PCR分析，檢測(cè)miR-21相對(duì)表達(dá)水平(≥3表示為表達(dá)陽(yáng)性)，以U6作為內(nèi)非腫瘤組織。

3. 觀察指標(biāo)：分析所有病人的臨床一般資料與病理資料；隨訪至今，記錄病人的預(yù)后。資料收集完畢后，對(duì)記錄項(xiàng)目統(tǒng)一進(jìn)行編碼與保管。

三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.miR-21、VEGF、MMP-9表達(dá)比較見(jiàn)表1。結(jié)果表明，腫瘤組織的miR-21、VEGF、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率高于非腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 miR-21、VEGF、MMP-9表達(dá)情況(例，%)

2. 結(jié)直腸癌VEGF、MMP-9和miR-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表2、表3、表4。在144例病人中，腫瘤組織miR-21、VEGF、MMP-9的表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤直徑密切相關(guān)(P<0.05)。

表2 結(jié)直腸癌VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

表3 結(jié)直腸癌MMP-9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

表4 結(jié)直腸癌miR-21表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3. 預(yù)后情況:所有病人隨訪到2019年10月，死亡34例，死亡率為23.6%。

4.影響因素分析見(jiàn)表5。結(jié)果表明，在144例病人中，以是否死亡作為因變量，以miR-21、VEGF、MMP-9作為自變量納入COX回歸模型，結(jié)果顯示,miR-21、VEGF、MMP-9等是影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素(P<0.05)。

表5 影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素

討論

隨著人口老齡化，飲食習(xí)慣及生活方式的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年增加。以手術(shù)為基礎(chǔ)的綜合治療為結(jié)直腸癌的主要治療方法。腹腔鏡下結(jié)直腸癌根治手術(shù)創(chuàng)傷小、恢復(fù)快，是結(jié)直腸癌手術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)術(shù)式。但是也有部分病人預(yù)后不佳，說(shuō)明病人自身相關(guān)因子的表達(dá)情況可影響病人預(yù)后[6]。

VEGF的高表達(dá)與血管生成、動(dòng)脈粥樣硬化等有顯著相關(guān)性，在結(jié)直腸癌進(jìn)展過(guò)程發(fā)揮重要作用。MMP-9高表達(dá)情況下可使得膠原和明膠等發(fā)生降解作用，促使腫瘤微淋巴管的新生，也可促使腫瘤細(xì)胞突破基底膜導(dǎo)致浸潤(rùn)性轉(zhuǎn)移發(fā)生[4]。MMP-9在結(jié)直腸癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、食管癌中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移能力與MMP-9的過(guò)表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)。腫瘤特異性的miRNAs表達(dá)譜對(duì)腫瘤的鑒別診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)具有重大的意義[7]。miR-21是由72nt的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體加工成熟的miRNA，其編碼基因位于17q23.2染色體區(qū)域，具有原癌基因活性，可調(diào)節(jié)VEGF與MMP-9的表達(dá)情況，從而參與細(xì)胞增殖和侵襲并抑制細(xì)胞凋亡，抑制靶基因的的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲與轉(zhuǎn)移[8]。本研究顯示，腫瘤組織miR-21、VEGF、MMP-9表達(dá)陽(yáng)性率高于非腫瘤組織；腫瘤組織的miR-21、VEGF、MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤直徑密切相關(guān)，表明結(jié)直腸癌病人伴隨有miR-21、VEGF、MMP-9的高表達(dá)。

本研究COX回歸模型結(jié)果顯示，miR-21、VEGF、MMP-9等是影響結(jié)直腸癌病人預(yù)后的因素，表明miR-21、VEGF、MMP-9的表達(dá)可能影響病人的預(yù)后。本研究隨訪時(shí)間短，沒(méi)有對(duì)miR-21、VEGF、MMP-9之間的相互關(guān)系進(jìn)行深入分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集存在差異。