周年，王安華，洪燕，鄭洋濱，劉寧

1.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029；2.南昌軌道交通集團(tuán)有限公司，南昌 330038

破傷風(fēng)抗毒素是經(jīng)典的一種馬抗血清制品，它能中和血液中破傷風(fēng)梭菌產(chǎn)生的破傷風(fēng)毒素，緩解破傷風(fēng)癥狀和降低病死率。人類應(yīng)用破傷風(fēng)抗毒素防治破傷風(fēng)歷史已近百年，挽救了許多人的生命，但其臨床應(yīng)用存在一定的局限性［1］。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的破傷風(fēng)抗毒素有效成分F（ab'）2純度較低，殘存的大分子馬免疫球蛋白（IgG）及小分子雜蛋白引起的不良反應(yīng)發(fā)生率高，制約了破傷風(fēng)抗毒素的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步發(fā)展。因此本研究根據(jù)破傷風(fēng)抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子雜蛋白分子量的不同，擬應(yīng)用凝膠排阻層析，以紫外檢測蛋白質(zhì)特征峰A280nm 繪制的散點圖為評價指標(biāo)，考察不同流速、洗脫劑、樣品濃度對破傷風(fēng)抗毒素蛋白分離的影響，經(jīng)非還原型十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳后對不同組分染色結(jié)果進(jìn)行掃描對比；按照《中國藥典》2015 版異常毒性檢查法對純化后的組分進(jìn)行安全性檢查。

1 材料與方法

1.1 材料

破傷風(fēng)抗毒素（0.75 mL，1 500 IU/支），購自江西生物制品研究所，批號：20 180106；葡聚糖凝膠G-100（Sephadex G-100）（批號：10244707，瑞典GE healthcare Bio-Science）；磷酸二氫鉀（批號：20180703，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（批號：20160518，廣東光華科技股份有限公司）；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（10-180 KDa）：（伊萊薩，批號：EL2661）；常規(guī)考馬斯亮藍(lán)染色液，批號：1210A19，Tris-HCl 緩沖液（0.5 mol/L，pH6.8），丙烯酰胺-亞甲基雙丙烯酰胺溶液（30%，29∶1），批號：1210A19，均購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 實驗動物

健康豚鼠4 只，雄性，體重250～350 g，動物合格證號：No.1107262011 001398；健康KM 小鼠10 只，雌雄各半，體重18～22 g，動物合格證號：No.430726201100264323，均購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）：2019-0014。小鼠、豚鼠分別飼養(yǎng)于本院屏障環(huán)境和普通環(huán)境中，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）：2019-0001。

1.3 儀器與設(shè)備

SBS-100 數(shù)控計滴自動部分收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；FreeZone?2.5 升冷凍干燥機（美國labconco 公司）；UV-2600 紫外分光光度計（日本島津）；Bio-Rad 電泳儀（美國伯樂公司）；Milli-Q Reference 超純水儀（密理博）；UW2200H動物天平（日本島津）。

1.4 Sephadex G-100 正式裝柱處理流程

1.4.1 預(yù)處理 用超純水煮沸至少1 h 直至充分溶脹，凝膠體積不再變化，期間不斷攪拌以保證凝膠溶脹。在溶脹前，自然沉降后若上層溶液中漂浮的凝膠碎片顆粒較多，需要重復(fù)多次漂洗將其除去，防止層析時阻塞凝膠柱影響流速。

1.4.2 裝柱 將溶脹好的凝膠根據(jù)裝柱要求一次性置入玻璃柱內(nèi)，注意保持濕態(tài)裝柱，并避免柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或斷層，裝柱要均勻。

1.5 破傷風(fēng)抗毒素凝膠排阻層析分離、純化條件的研究

經(jīng)過預(yù)處理的Sephadex G-100 進(jìn)行裝柱，凝膠柱規(guī)格：150 cm×2.5 cm，先用洗脫液平衡直到流出液的pH 值等于上柱洗脫液的pH 值后，上樣、洗脫。檢測波長：280 nm，采用數(shù)控計滴自動部分收集器每間隔一段時間收集一管洗脫組分。每個組分管重復(fù)收集5 次，合并相同次數(shù)的組分，冷凍干燥，進(jìn)行異常毒性檢查。

1.5.1 不同洗脫液流速 根據(jù)凝膠柱規(guī)格，按照分級分離原則將上樣體積約定為柱床體積的1%即為5 mL。以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，樣品濃度為原液（100%），分別控制流速為0.6 mL/min、0.3 mL/min，研究不同流速對破傷風(fēng)抗毒素蛋白分離效果影響。

1.5.2 不同洗脫液 固定上樣體積為5 mL，樣品濃度為100%，洗脫液流速0.3 mL/min，分別以超純水、磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，研究不同洗脫液對破傷風(fēng)抗毒素蛋白分離效果影響。

1.5.3 不同樣品濃度 以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）作為洗脫液，固定上樣體積為5 mL，流速為0.3 mL/min，樣品濃度分別為80%、100%，研究上樣濃度對破傷風(fēng)抗毒素蛋白分離效果影響。

1.6 經(jīng)Sephadex G-100 純化前后F（ab'）2 電泳染色圖對比

根據(jù)紫外檢測蛋白質(zhì)特征峰A280nm繪制的散點圖，取經(jīng)Sephadex G-100 純化后處于散點圖峰值附近的四管組分管（分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），加4×上樣緩沖液混勻后100 ℃水浴5 min，經(jīng)非還原型SDS-PAGE 凝膠電泳（上樣量：8 μL；以恒壓60 V 條件開始電泳至跑至分離膠調(diào)至100 V）后，參照考馬斯亮藍(lán)染色液說明書將電泳后的凝膠染色，脫水至條帶清晰后拍照保存，并將圖像背景調(diào)至白色，蛋白條帶為灰色。

1.7 經(jīng)Sephadex G-100 純化后Ⅲ組分異常毒性的檢查

選取上述1.6 的Ⅲ組分管，重復(fù)收集5 次，合并相同的組分，冷凍干燥，按照《中國藥典》2015版異常毒性檢查法進(jìn)行異常毒性檢查。

2 結(jié)果

2.1 不同洗脫液流速對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

由圖1 可以發(fā)現(xiàn)，A 流速（0.3 mL/min）的分離效果優(yōu)于B 流速（0.6 mL/min），因此，本實驗選擇洗脫流速為0.3 mL/min。

2.2 不同洗脫液對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

由圖2 可知，不同的洗脫液對Sephadex G-100分離蛋白效果基本無影響，對上樣的樣品進(jìn)行pH檢測結(jié)果為6.5。為更好地考慮整個分離過程中樣品的穩(wěn)定性，我們選擇跟樣品相同pH 的磷酸鹽緩沖液作為洗脫液。

2.3 不同樣品濃度對Sephadex G-100 分離蛋白效果的影響

從圖3 可看出，當(dāng)上樣濃度為100% 時，分離效果更好，同時凝膠排阻層析分離會使樣品稀釋，因此，在不影響分離效果的前提下，應(yīng)盡可能提高上樣濃度。即本實驗選擇樣品濃度為100%。

2.4 破傷風(fēng)抗毒素有效成分F（ab'）2 經(jīng)Sephadex G-100 純化前后電泳染色圖對比

綜合2.1～2.3 的實驗結(jié)果，凝膠排阻層析分離破傷風(fēng)抗毒素蛋白的優(yōu)化條件為以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）為洗脫液，樣品濃度為100%，流速為0.3 mL/min。選取處于散點圖兩個峰值附近的四管組分管（Ⅰ、Ⅱ為第一個峰值附近的兩管，Ⅲ、Ⅳ為第二個峰值附近的兩管）。從圖4 可知，整個純化過程中，I 組分為少量大分子IgG 與有效成分F（ab'）2先洗脫下來，Ⅱ組分為IgG、F（ab'）2與少量的小分子雜蛋白共同洗脫下來，Ⅲ組分主要為F（ab'）2洗脫下來，最后Ⅳ組分為F（ab'）2、小分子雜蛋白共同洗脫下來。其中Ⅲ組分F（ab'）2的純度最高。

2.5 經(jīng)Sephadex G-100 純化后Ⅲ組分異常毒性的檢查

取純化后重復(fù)五次收集的Ⅲ組分，經(jīng)冷凍干燥后，加入無菌生理鹽水溶解，分別采用小鼠及豚鼠腹腔注射溶液的方式（小鼠注射劑量為0.5 mL；豚鼠注射劑量為5 mL），觀察注射后反應(yīng)情況和7 d內(nèi)的死亡情況。結(jié)果小鼠及豚鼠觀察期內(nèi)均健存，且無眼球突出、呼吸急促、行動失調(diào)、昏倒、麻痹、匍匐、痙攣、驚厥等反應(yīng)，7 d 后小鼠及豚鼠的體重均增加，表示Ⅲ組分無異常毒性。

3 討論

當(dāng)前破傷風(fēng)抗毒素的生產(chǎn)工藝主要為破傷風(fēng)類毒素免疫馬匹后采集的血漿經(jīng)胃蛋白酶消化，后者在IgG 鉸鏈區(qū)二硫鍵的近羧基端處將其剪切為F（ab'）2片段和若干無生物活性的小分子多肽pFc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性雜質(zhì)及Fc 片段，最后超濾除鹽、濃縮和去小分子蛋白。主要表現(xiàn)為有效成分F（ab'）2、大分子IgG 和小分子雜蛋白同時存在。大分子IgG 容易導(dǎo)致過敏性休克和血清病兩類過敏反應(yīng)；小分子雜蛋白則是引起皮膚過敏試驗假陽性反應(yīng)的主要物質(zhì)，所以破傷風(fēng)抗毒素在臨床使用前必須進(jìn)行皮膚過敏試驗，簡稱皮試。據(jù)文獻(xiàn)資料報道，破傷風(fēng)抗毒素的皮試陽性率達(dá)到52.5%，并且無論采用皮試陰性直接注射還是皮試陽性脫敏注射的方法，注射破傷風(fēng)抗毒素均有較多的過敏反應(yīng)產(chǎn)生［2-4］，因此在一些歐美發(fā)達(dá)國家早已禁止使用馬源破傷風(fēng)抗毒素，而選擇20 世紀(jì)60 年代研制出的人破傷風(fēng)免疫球蛋白代替，但由于存在市場血源供應(yīng)嚴(yán)重不足、價格昂貴、產(chǎn)量極其不穩(wěn)定、同源污染等缺點，因而在我國臨床上廣泛應(yīng)用于破傷風(fēng)被動免疫和破傷風(fēng)治療的仍為破傷風(fēng)抗毒素［5］。

《中國藥典》2015 版破傷風(fēng)抗毒素檢驗項下F（ab'）2含量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定預(yù)防用及治療用從2010 版的應(yīng)不低于50%及60%提升到了應(yīng)不低于60%及70%，同時IgG 含量也從應(yīng)不高于10%降低為應(yīng)不高于5%［6,7］?？梢娽槍ζ苽L(fēng)抗毒素生產(chǎn)工藝的發(fā)展現(xiàn)狀及其臨床使用的局限性，我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)提高了對此類生物制品純化工藝的要求，建議增加柱色譜、免疫吸附等純化技術(shù)和完善酶解工藝［8,9］。本研究根據(jù)破傷風(fēng)抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子雜蛋白分子量的不同，使用Sephadex G-100裝柱，以紫外檢測蛋白質(zhì)特征峰A280nm繪制的散點圖為評價指標(biāo)，采用單因素試驗考察不同流速、洗脫液、樣品濃度對破傷風(fēng)抗毒素蛋白分離的影響。確定了凝膠排阻層析純化破傷風(fēng)抗毒素蛋白的最佳條件為以磷酸鹽緩沖液（pH6.5）為洗脫液，樣品濃度為100%，流速為0.3 mL/min；經(jīng)非還原型SDS-PAGE 凝膠電泳結(jié)果表明在該條件下可以較好地純化破傷風(fēng)抗毒素有效成分F（ab'）2，其中Ⅲ組分F（ab'）2的純度最高；異常毒性檢查小鼠及豚鼠均正常存活，表明Ⅲ組分無異常毒性。說明優(yōu)化的凝膠排阻層析條件可以較好地純化破傷風(fēng)抗毒素有效成分，且安全無毒，為進(jìn)一步推動該類生物制品的質(zhì)量提高提供參考。