許瀚元，朱惠娟，潘 慧，陽(yáng)洪波，王林杰，龔鳳英

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 內(nèi)分泌科 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)內(nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730)

脂聯(lián)素(adiponectin)是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的脂肪細(xì)胞因子，主要作用于肝臟和脂肪組織，發(fā)揮調(diào)節(jié)脂代謝、增加胰島素敏感性、抗感染等的作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者的血清脂聯(lián)素水平降低[2]。脂聯(lián)素過(guò)表達(dá)能使高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中三酰甘油含量下降，內(nèi)臟脂肪組織減少[3]。進(jìn)一步研究表明，脂聯(lián)素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪合成與分解相關(guān)酶表達(dá)參與脂代謝的調(diào)節(jié)[4]。

脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)AS)與激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive lipase, HSL)分別是在脂肪合成與分解過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶[5]。研究報(bào)道，脂聯(lián)素受體激動(dòng)劑能夠抑制C3H10T1/2小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞中FAS的表達(dá)[6]，而脂聯(lián)素干預(yù)原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞能夠使細(xì)胞中HSL mRNA的表達(dá)量上升[7]。但關(guān)于脂聯(lián)素對(duì)人肝細(xì)胞中FAS與HSL表達(dá)的影響目前尚無(wú)相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究旨在通過(guò)構(gòu)建含人FAS與HSL啟動(dòng)子的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，探究脂聯(lián)素對(duì)人肝癌細(xì)胞系(human hepatocarcinoma cell line)HepG2細(xì)胞中FAS及HSL啟動(dòng)子活性的影響，為進(jìn)一步揭示脂聯(lián)素調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂代謝的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

DMEM/NEAA培養(yǎng)基(Hyclone公司)；Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(Gibco公司)；LipofactamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司);微孔板發(fā)光分析儀(北京濱松光子技術(shù)有限公司，BHP9504);人血DNA提取試劑盒(Omega公司);雙熒光素酶測(cè)定試劑盒、pGL3-Basic質(zhì)粒、pRL-SV40質(zhì)粒及pBS-T質(zhì)粒(Promega公司);人肝癌細(xì)胞系HepG2(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心);重組人球形脂聯(lián)素(Peprotech 公司);DNA測(cè)序由上海生工生物科技公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組與處理

1.2.1.1 構(gòu)建pGL3-hFAS625-Luc熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒： PCR擴(kuò)增FAS-(622～+3 bp)片段，上游引物序列為：5′-TATTAACCACCCGTGTGCGCATTGGGCCG-3′，下游引物序列為：5′-CTCTAGGCCGGCGCCGA CGCTATTTAAAC-3′，產(chǎn)物大小為625 bp，經(jīng)測(cè)序證實(shí)為FAS基因啟動(dòng)子序列后，用T4 DNA連接酶將這一片段插入過(guò)渡載體pBS-T中，然后用SalⅠ和HindⅢ 同時(shí)雙酶切這一質(zhì)粒和pGL3-Basic質(zhì)粒(不含啟動(dòng)子和增強(qiáng)子)，分別得到帶這兩個(gè)雙酶切位點(diǎn)的FAS啟動(dòng)子序列插入片段和pGL3-Basic載體片段，用T4 DNA連接酶將二者連接，構(gòu)建成含人FAS啟動(dòng)子(-622～+3 bp)的pGL3-hFAS(-622～+3 bp)-Luc (hFAS625-Luc)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列正確。

1.2.1.2 構(gòu)建pGL3-hHSL750-Luc熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增HSL(-697～+53 bp)啟動(dòng)子，上游引物：5′-ATCTGTGGAATGACACGGGTGAATGAC-3′，下游引物：5′-CCTCCTAGGCATCTTCCGAGCTTCC-3′；產(chǎn)物大小為750 bp，測(cè)序證實(shí)后采用和1.2.1.1中同樣的方法，構(gòu)建成含人HSL啟動(dòng)子(-697～+53 bp)的pGL3-hHSL(-697～+53 p)-Luc (hHSL750-Luc)熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序證實(shí)序列正確。

1.2.1.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc及hHSL750-Luc熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及其活性測(cè)定：采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法。將增殖狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞以8×10個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，匯合度為50%～60%時(shí)，換為新鮮無(wú)血清DMEM/NEAA培養(yǎng)液，按本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表的文獻(xiàn)操作[8]，配置含不同濃度目的質(zhì)粒hFAS625-Luc或hHSL750-Luc質(zhì)粒以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-SV40的A液和含LipofactamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑的B液，將A、B兩液混合，室溫孵育20 min后，加入上述準(zhǔn)備好的HepG2細(xì)胞6孔板中， 37 ℃ CO2孵箱孵育5 h后，更換為DMEM/NEAA培養(yǎng)基。40 h后，加入1×報(bào)告基因裂解緩沖液，刮下細(xì)胞，離心5 min，取20 μL上清細(xì)胞裂解液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入100 μL LARII熒光素酶反應(yīng)試劑，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光值，再加入100 μL Stop&Glo試劑，測(cè)定海腎熒光素酶活性，計(jì)算兩組數(shù)據(jù)的比值。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，取每孔標(biāo)本的平均值。將轉(zhuǎn)染0 μg目的質(zhì)粒的細(xì)胞的熒光素酶活性測(cè)定值為1，轉(zhuǎn)染不同劑量目的質(zhì)粒的細(xì)胞的熒光素酶活性與之相比得出相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.2 脂聯(lián)素對(duì)FAS和HSL啟動(dòng)子活性的影響

1.2.2.1 不同濃度脂聯(lián)素對(duì)FAS和HSL啟動(dòng)子活性的影響：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，同樣采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，每孔細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染1.0 μg hFAS625-Luc或者h(yuǎn)HSL750-Luc和0.07 μg pRL-SV40內(nèi)參照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，更換為DMEM/NEAA培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)40 h。將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組不做處理，實(shí)驗(yàn)組分別加入0.5、1.0、2.0、5.0及10.0 μg/mL的脂聯(lián)素，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，裂解細(xì)胞，按照1.2.1.3中描述方法檢測(cè)熒光素酶活性，以不加脂聯(lián)素干預(yù)的對(duì)照組熒光素酶活性為1，其他組與之相比得到相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.2.2 脂聯(lián)素作用不同時(shí)間對(duì)FAS和HSL啟動(dòng)子活性的影響：培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，利用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染同等劑量的hFAS625-Luc或hHSL750-Luc和pRL-SV40內(nèi)參照質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)40 h。細(xì)胞分組及檢測(cè)方法如1.2.2.1，其中實(shí)驗(yàn)組以5 μg/mL的脂聯(lián)素干預(yù)細(xì)胞，分別在干預(yù)后的2、4、8、16、32 h裂解細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶的活性，計(jì)算得到相對(duì)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 成功構(gòu)建含人FAS(hFAS)啟動(dòng)子序列的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒：瓊脂糖凝膠電泳鑒定，hFAS625-Luc質(zhì)粒在紫外燈下可見(jiàn)約在5 401 bp有目的條帶。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可見(jiàn)載體(4 776 bp)和目的(625 bp)片段(圖1A)，將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序證實(shí)序列完全正確。

2.1.2 成功構(gòu)建含人HSL(hHSL)啟動(dòng)子序列的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒： 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，hHSL750-Luc質(zhì)粒在紫外燈下可見(jiàn)約在5 446 bp有目的條帶，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切可見(jiàn)載體(4 696 bp)和目的(750 bp)片段(圖1B)，將構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序證實(shí)序列完全正確。

2.2 含hFAS和hHSL啟動(dòng)子序列質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2.1 hFAS625-Luc質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況：hFAS625-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞40 h后能良好表達(dá)，熒光素酶的絕對(duì)值在十幾萬(wàn)～幾百萬(wàn)之間，而且隨著質(zhì)粒濃度的增加，熒光素酶的表達(dá)量進(jìn)一步增高，峰值達(dá)到未轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組的14.45倍(P<0.01)(圖2A)。

2.2.2 hHSL750-Luc熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)情況：hHSL750-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞40 h后能良好表達(dá)，熒光素酶的絕對(duì)值在幾萬(wàn)～二十幾萬(wàn)之間，而且隨著質(zhì)粒濃度的增加，熒光素酶的表達(dá)進(jìn)一步增高，峰值達(dá)到未轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒組的8.49倍(P<0.01)(圖2B)。

A:pGL3-hFAS(-622～+3 bp)-Luc(FAS625-Luc) plasmid, M1.DNA marker DL4000; M2.DNA marker DL2000, 1～3.established FAS625-Luc plasmid (5 401 bp), 1′, 2′, 3′.fragments from pGL3-hFAS(-622～+3 bp)-Luc(hFAS625-Luc) plasmid when digested by SalⅠ and HindⅢ (4 776/625 bp); B:pGL3-hHSL(-697～3 bp)-Luc(hHSL750-Luc) plasmid, 1.standard DNA molecular weight(1 kb), 2.vector fragment from pGL3-hHSL-Luc plasmid when digested by EcoRⅠ and HindⅢ(4 696 bp), 3.established hHSL750-Luc plasmid (5 446 bp), 4.vector fragment from pGL3-basic plasmid digested by EcoRⅠ and HindⅢ(4 696 bp), 5.inserting fragment from hHSL750-Luc(750 bp) plasmid digested by EcoRⅠ and HindⅢ (750 bp), 6.standard DNA molecular weight: DL2000圖1 質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳鑒定Fig 1 Verification of plasmid by agarose electrophoresis

A.hFAS 625-Luc plasmids; B.hHSL750-Luc plasmids; *P<0.01 compared with control group圖2 不同量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后的熒光素酶表達(dá)情況Fig 2 Luciferase activity of HepG2 cells transfected with different amounts of n=6)

2.3 脂聯(lián)素對(duì)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響

2.3.1 不同濃度脂聯(lián)素對(duì)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響： 0.5 μg/mL的脂聯(lián)素有促進(jìn)HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的趨勢(shì)，隨著劑量逐漸增加，熒光素酶表達(dá)量也逐漸增加，1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL的脂聯(lián)素干預(yù)后熒光素酶表達(dá)量分別是對(duì)照組的1.18倍(P<0.01)，1.31倍(P<0.01)，1.58倍和1.76倍(P<0.01)。提示脂聯(lián)素能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中hFAS啟動(dòng)子活性，且其促進(jìn)作用呈劑量依賴(lài)性(圖3A)。

2.3.2 脂聯(lián)素作用不同時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響:5 μg/mL的脂聯(lián)素干預(yù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hFAS625-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞4 h及8 h后，均能促進(jìn)熒光素酶的表達(dá)熒光素酶表達(dá)，分別為對(duì)照組的1.31倍(P<0.01)和1.23倍(P<0.01)。而在作用16及32 h后，脂聯(lián)素對(duì)熒光素酶表達(dá)出現(xiàn)抑制作用，其熒光素酶表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.87倍(P<0.01)及0.67倍(P<0.01)，提示以脂聯(lián)素對(duì)FAS啟動(dòng)子活性的影響與作用時(shí)間密切相關(guān)(圖3B)。

2.4 脂聯(lián)素對(duì)轉(zhuǎn)染hHSL750-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響

2.4.1 不同濃度脂聯(lián)素對(duì)轉(zhuǎn)染hHSL750-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響：0.5 μg/mL脂聯(lián)素有促進(jìn)HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的趨勢(shì)，其熒光素酶表達(dá)量是對(duì)照組的1.11倍。但隨著濃度逐漸增加，熒光素酶表達(dá)量逐漸增加，1.0、2.0、5.0和10.0 μg/mL脂聯(lián)素干預(yù)后，細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照組的1.24倍(P<0.01)、1.28倍(P<0.01)、1.29倍(P<0.01)和1.37倍(P<0.01)，提示脂聯(lián)素能夠促進(jìn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hHSL750-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中hHSL啟動(dòng)子活性，且其促進(jìn)作用呈劑量依賴(lài)性(圖4A)。

2.4.2 脂聯(lián)素作用不同時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染hHSL750-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)量的影響:5 μg/mL脂聯(lián)素干預(yù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hHSL750-Luc質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞2 h能明顯促進(jìn)熒光素酶的表達(dá)，達(dá)到對(duì)照組的1.37倍(P<0.01)。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，其促進(jìn)熒光素酶表達(dá)的作用幅度沒(méi)有繼續(xù)增強(qiáng)，4、8、16和32 h后熒光素酶活性分別為對(duì)照組的1.24倍(P<0.01)、1.21倍(P<0.01)、1.22倍(P<0.01)和1.23倍(P<0.01)， 提示以脂聯(lián)素干預(yù)能促進(jìn)HepG2細(xì)胞中hHSL啟動(dòng)子的活性，且其促進(jìn)作用在2 h時(shí)達(dá)到頂峰，并在4～32 h時(shí)間區(qū)間內(nèi)其促進(jìn)作用沒(méi)有隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加(圖4B)。

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with the prior group圖3 不同濃度脂聯(lián)素(A)與脂聯(lián)素作用不同時(shí)間(B)對(duì)轉(zhuǎn)染hFAS啟動(dòng)子的HepG2細(xì)胞中熒光素酶活性的影響Fig 3 Effect of different concentrations (A) and different action times (B) on luciferase activity in HepG2 cells transfected with hFAS 625-Luc n=6)

*P<0.01 compared with control group; #P<0.01 compared with the prior group圖4 不同濃度脂聯(lián)素(A)與脂聯(lián)素作用不同時(shí)間(B)對(duì)轉(zhuǎn)染hHSL啟動(dòng)子的HepG2細(xì)胞中熒光素酶活性的影響Fig 4 Effect of different concentrations (A) and different action times (B) on luciferase activity in HepG2 cells transfected with hHSL 750-Luc n=4)

3 討論

本研究成功構(gòu)建含人FAS及HSL啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染人肝HepG2細(xì)胞，觀(guān)察了脂聯(lián)素對(duì)FAS與HSL啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素能夠劑量依賴(lài)性地促進(jìn)FAS啟動(dòng)子的活性。與本研究結(jié)果一致，3T3-L1脂肪細(xì)胞中過(guò)表達(dá)脂聯(lián)素，能使細(xì)胞胞內(nèi)脂滴體積更大，脂肪合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如CAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CAAT/ enhancer binding protein，C/EBPα)等表達(dá)上調(diào)[9]。同時(shí)，在脂聯(lián)素基因敲除的小鼠中也發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素敲除小鼠肝臟中FAS表達(dá)水平是下降的[10]。但與上述研究結(jié)果不同的是，以25 μg/mL脂聯(lián)素對(duì)FaO細(xì)胞作用8 h后，細(xì)胞中FAS的表達(dá)量顯著下降[11]；此外，在HepG2肝細(xì)胞中過(guò)表達(dá)脂聯(lián)素受體，F(xiàn)AS的表達(dá)明顯降低[12]。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，脂聯(lián)素干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠2周后，肝臟FAS的表達(dá)明顯下降[13]。且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)脂聯(lián)素受體的高脂飲食喂養(yǎng)小鼠，體質(zhì)量降低，脂肪組織質(zhì)量減輕，同時(shí)肝臟FAS的表達(dá)也明顯下降[14]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不一致可能是由于實(shí)驗(yàn)所用脂聯(lián)素劑量不同，采用的動(dòng)物模型不同以及干預(yù)的時(shí)間不同所致，具體機(jī)制仍需更多實(shí)驗(yàn)探索。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素作用4和8 h能促進(jìn)hFAS啟動(dòng)子的活性，而在作用16及32 h后，則轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔?。結(jié)合前述脂聯(lián)素濃度依賴(lài)性對(duì)HepG2細(xì)胞中FAS啟動(dòng)子活性的影響的作用時(shí)間是24 h，說(shuō)明脂聯(lián)素對(duì)FAS啟動(dòng)子活性的影響出現(xiàn)先升高(4和8 h)，再降低(16 h)，再升高(24 h)，再降低(32 h)的變化趨勢(shì)。與此結(jié)果相似， 在FaO肝細(xì)胞中也觀(guān)察到，以脂聯(lián)素干預(yù)FaO細(xì)胞2 h對(duì)FAS的表達(dá)有促進(jìn)趨勢(shì)，而在干預(yù)8 h后則轉(zhuǎn)變?yōu)橐种谱饔肹11]。這些結(jié)果提示，脂聯(lián)素對(duì)FAS表達(dá)的影響與作用時(shí)間有關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素能夠劑量及時(shí)間依賴(lài)性地促進(jìn)HepG2細(xì)胞中HSL啟動(dòng)子活性。與此結(jié)果一致，脂聯(lián)素也能夠促進(jìn)C2C12成肌細(xì)胞中的脂肪分解[15]。 類(lèi)似的，還有研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，脂聯(lián)素敲除小鼠肝臟HSL mRNA表達(dá)降低[16]。這些結(jié)果提示，脂聯(lián)素能夠通過(guò)促進(jìn)肝細(xì)胞HSL啟動(dòng)子活性，促進(jìn)肝細(xì)胞中脂肪分解。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建hFAS625-Luc及hHSL750-Luc質(zhì)粒并利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)使該質(zhì)粒在HepG2細(xì)胞中良好表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素能夠劑量依賴(lài)性地促進(jìn)FAS及HSL啟動(dòng)子活性，而脂聯(lián)素對(duì)FAS啟動(dòng)子活性影響與作用時(shí)間相關(guān)，而對(duì)HSL啟動(dòng)子活性則一直表現(xiàn)為促進(jìn)作用。這些研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了脂聯(lián)素調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂肪合成和脂肪分解的作用，為未來(lái)將脂聯(lián)素應(yīng)用于改善肝臟脂代謝異常的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。