王靈慧，吳 霜，堵晶晶，張锫文，王定國，楊東麗，張順華，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點實驗室，成都 611130；2.成都市動物疫病預(yù)防控制中心，成都 610041；3.瀘州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川瀘州 646000）

肝是人體重要器官，其與維生素合成與儲存、膽汁分泌排泄、有毒物質(zhì)代謝及血液生成密切相關(guān)[1]。此外，作為胰島素的作用器官，肝不僅可通過糖異生作用生成葡萄糖，還可將其攝取的葡萄糖以糖原形式儲存。當(dāng)機體低血糖時該部分糖原分解并釋放入血，維持葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)[2]。然而，越來越多的研究證據(jù)表明，當(dāng)肥胖者血液所含的游離脂肪酸水平超過肝臟代謝能力時，多余的游離脂肪酸會重新轉(zhuǎn)化為甘油三酯儲存于肝臟中，進而造成肝功能障礙，損傷脂肪酸代謝與脂蛋白合成，誘發(fā)系統(tǒng)性的胰島素抵抗和2型糖尿病[3]。因此，發(fā)掘可預(yù)防或治療非酒精性脂肪肝的藥物、清除肝細(xì)胞內(nèi)過度沉積的脂質(zhì)對于發(fā)揮肝臟的正常功能和維持機體代謝穩(wěn)態(tài)極為重要。

甜菜堿是一種來源于日常食物的天然小分子，能在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán)，可參與蛋白質(zhì)代謝、誘食、調(diào)節(jié)機體滲透壓、抗應(yīng)激及抗氧化等復(fù)雜生物學(xué)過程[4]。例如，甜菜堿可顯著抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，阻滯細(xì)胞進入G2/M期，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。補充甜菜堿可以降低慢性腎功能衰竭患者的高同型半胱氨酸血癥[6]。越來越多的研究表明，除可提高動物生產(chǎn)性能和改善畜產(chǎn)品品質(zhì)外，甜菜堿還可顯著減少高脂飲食誘導(dǎo)的白色脂肪細(xì)胞肥大和胰島素抵抗，改善非酒精性脂肪肝炎患者的生化及組織學(xué)指標(biāo)。如在患酒精性脂肪肝的大鼠的飼糧中添加甜菜堿，不僅可延緩其肝臟炎癥進程，還可改善其肝臟的病理損傷[7]。然而，甜菜堿對高脂飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)脂肪積累及肝損傷的影響及其具體機制尚不完全明晰。我們擬通過飲水補飼1%甜菜堿來探究甜菜堿對高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝內(nèi)脂肪積累及肝損傷的影響，以期為非酒精性脂肪肝相關(guān)疾病治療提供理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本試驗已獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實驗動物護理和使用委員會批準(zhǔn)。6周齡雌性昆明鼠與高脂飼料購自成都達碩實驗動物有限公司。試驗期間，小鼠自由采食、飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±4）℃，光照規(guī)律晝夜交替。

1.1.2 主要試劑和儀器

甘油三酯試劑盒購自南京建成生物工程研究所（南京，中國）；甜菜堿、油紅O染液購自Sigma公司（美國）；TRIzol RNA抽提試劑盒購自Invitrogen公司（美國）；SYBR Premix Ex Taq試劑盒、mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA定量試劑盒購自TaKaRa公司（大連，中國）；使用CFX96熒光定量儀、Olympus IX53熒光顯微鏡。

2 方法

2.1 實驗動物分組飼養(yǎng)及樣品采集

將24只6周齡雌性昆明小鼠隨機均分為2組，分別飼喂高脂飼糧（HFD）、高脂飼糧+1%（m/v）甜菜堿（HFD+Bet）。飼養(yǎng)2個月后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，摘取肝臟組織并稱重，將樣品存放于液氮中，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。

2.2 血清指標(biāo)檢測

利用眼球采血法收集小鼠血液，所得血液室溫靜置30 min后，3 000 g離心15 min，收集血清儲存于-80℃。隨后，根據(jù)ELISA試劑盒說明書對血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的含量進行檢測。

2.3 甘油三酯的測定

稱?。?.33±0.2）g肝組織，按重量（g）:體積（mL）=1:9的比例，加入9倍體積的無水乙醇，冰水浴條件下機械勻漿，2 500 r/min，離心 10 min，取 2.5 μL上清液于96孔平底酶標(biāo)板中，加入250 μL工作液，每組設(shè)置6個重復(fù)。另外取2.5 μL蒸餾水加入250 μL工作液作為空白孔；取2.5 μL標(biāo)準(zhǔn)品加入250 μL工作液作為標(biāo)準(zhǔn)孔?；靹颍?7℃孵育10 min；隨后利用多功能酶標(biāo)儀在510 nm波長處測定各孔吸光度值。根據(jù)試劑說明書，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組對應(yīng)的甘油三酯含量。

2.4 HE和油紅O染色

將小鼠部分肝臟組織用4%多聚甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片，60～65℃烤片60 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，蘇木素染液染色1～5 min，自來水洗1min，1%鹽酸乙醇分化30s，自來水洗5 min，變藍，伊紅染液染色30 s～5 min，自來水洗1 min，經(jīng)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固；部分經(jīng)冰凍切片機切取15 μm的冰凍組織，將組織裱貼于載玻片，至切片恢復(fù)室溫，蒸餾水浸洗2 s，60%異丙醇浸洗2 s，油紅O染液浸染10 min，60%異丙醇浸染分色 2 s，蒸餾水洗 1 s，Mayer蘇木素復(fù)染 2 min，自來水洗（藍化）10 min，蒸餾水洗2 s，用濾紙吸干周圍水分，水溶性封片劑封固并在蓋玻片與載玻片交界邊緣用中性樹膠封閉。隨后在顯微鏡下對切片進行觀察并拍照。

2.5 脂肪酸含量檢測

稱取100 mg小鼠肝臟組織，勻漿后加入2 mL正己烷，50℃振搖30 min。加入3 mL KOH甲醇溶液（0.4 mol/L），50℃振搖衍生30 min。再加1 mL水、2 mL正己烷，混勻；靜置，待分層后取上清液。隨后，使用GC-MS 7890B-5977A氣相色譜儀檢對上清液中的脂肪酸含量進行檢測。上述操作均由北京質(zhì)樸豐科技有限公司完成。

2.6 實時熒光定量

根據(jù)Invitrogen公司 TRIzol試劑說明書，用TRIzol提取肝組織總RNA。用NanoDrop 2000超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性。而后，按照TaKaRa公司的mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)得到相應(yīng)的cDNA。隨后，使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒和CFX96熒光定量儀對脂肪酸代謝相關(guān)基因進行檢測，PCR反應(yīng)體系10 μL:cDNA 1 μL，上下游引物各 0.5 μL，SBYR Premix Ex Taq 5 μL，DEPC水3 μL。PCR反應(yīng)條件:90℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火 30 s，72℃延伸 15 s，共40個循環(huán)。以β-actin作為mRNA的內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt[8]方法計算各基因的相對表達量。實驗所用引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences used for qRT-PCR

2.7 數(shù)據(jù)分析

所有結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示；實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行Student's t-test分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；ns為差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 甜菜堿對HFD小鼠肝臟脂質(zhì)沉積及肝變性的影響

由圖1可知，HFD飼喂小鼠經(jīng)甜菜堿補飼一個月后，HFD+Bet組小鼠肝重較HFD組小鼠顯著減少（圖1A）。HE肝組織切片染色結(jié)果顯示:與HFD組小鼠相比，HFD+Bet組小鼠肝內(nèi)脂肪空泡數(shù)量較少、體積較小。同時，HFD+Bet組小鼠肝內(nèi)油紅著色脂滴的數(shù)量和體積較HFD組小鼠顯著減少（圖1B）。為進一步確定甜菜堿對高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝變性的改善效應(yīng)，對血清中ALT和AST水平進行檢測。結(jié)果表明:與HFD組小鼠相比，HFD+Bet組小鼠AST、ALT血清水平均顯著減少（圖1C），暗示甜菜堿可顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的肝損傷。

圖1 甜菜堿對HFD小鼠肝臟脂肪變性的影響Figure 1 The effects of betaine on fatty liver in HFD-fed mice

3.2 甜菜堿對肝甘油三酯及其調(diào)控因子的影響

由圖2可知，與HFD組小鼠相比，HFD+Bet組小鼠肝臟中甘油三酯的含量顯著下降。此外，對肝臟組織中的激素敏感脂肪酶（HSL）和三酰甘油脂肪酶（ATGL）進行實時熒光定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HFD+Bet組小鼠肝臟中HSL、ATGL含量較HFD組小鼠極顯著上升（圖2）。

3.3 甜菜堿對肝臟脂肪酸組成的影響

圖2 肝臟中甘油三酯的含量和ATGL、HSL表達水平檢測Figure 2 Triglyceride content in liver and expression levels of ATGL and HSL

與HFD組相比，HFD+Bet組小鼠肝臟中C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C18:1n9c、C18:2n6c 的含量分別下降77.4%、77.7%、61.9%、60.7%、82.7%、67.7%，但差異沒有達到顯著水平。相似地，C12:0、C22:0含量顯著下降，C20:0含量極顯著下降（圖3A）。為進一步探究甜菜堿對高脂飲食飼喂小鼠肝脂肪酸組成的影響，脂肪酸組成差異被進一步歸類分析。結(jié)果顯示，與HFD組相比，盡管飽和脂肪酸（SFA）、多不飽和脂肪酸（PUFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）的含量均顯著下降（圖3B），但HFD+Bet組小鼠肝臟中SFA及MUFA所占比例較HFD組下降，PUFA所占比例有所上升（圖3C）。

3.4 甜菜堿對脂肪酸代謝相關(guān)基因表達的影響

為探究甜菜堿對肝脂肪酸代謝的調(diào)控機制，進一步利用實時熒光定量技術(shù)檢驗脂肪酸代謝相關(guān)基因的表達水平。結(jié)果顯示:與HFD組相比，補充甜菜堿（HFD+Bet組）后，小鼠肝內(nèi)負(fù)責(zé)脂肪酸轉(zhuǎn)運、合成的關(guān)鍵調(diào)控基因 SREBP-1c、LPL、PPARγ、SCD-1、FAS的表達量顯著下降，促脂肪酸β氧化的關(guān)鍵基因PPARa、CD36、ACSS1和ACOX2的表達量呈增加趨勢，但ACOX2的表達差異沒有達到顯著水平（圖4）。

4 討論

超重或肥胖常伴有脂質(zhì)的異位沉積。大量的研究報道，肝內(nèi)脂質(zhì)積累會導(dǎo)致患非酒精性脂肪肝的風(fēng)險增加，引起胰島素抵抗。此外，于肝內(nèi)堆積的脂肪還會產(chǎn)生大量的致癌因子，其可誘發(fā)或促進癌癥的發(fā)生[9]。

圖3 肝臟中脂肪酸組成分析Figure 3 Fatty acid composition in the liver

圖4 肝脂肪酸代謝相關(guān)基因表達水平Figure 4 Expression levels of genes involved in fatty acid metabolism in the liver

本研究探究了甜菜堿對高脂飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)脂質(zhì)積累及肝變性的影響，將甜菜堿以飲水的方式飼喂給小鼠。2個月后發(fā)現(xiàn)，HFD+Bet組小鼠肝臟中的脂質(zhì)積累減少，與油紅O和HE染色的結(jié)果一致。同時，肝內(nèi)甘油三酯的含量也顯著減少（P＜0.01）。HSL是體內(nèi)分解脂肪組織中甘油三酯釋放游離脂肪酸的關(guān)鍵酶，在脂質(zhì)沉積過程中扮演著重要角色[10]。ATGL是具有脂質(zhì)水解酶活性的脂肪細(xì)胞特異性蛋白[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，ATGL失活會導(dǎo)致脂肪數(shù)量增加，并引起甘油三酯在多個組織中沉積[12]。與上述結(jié)果一致，本研究中HFD+Bet組小鼠與HFD組小鼠相比，肝內(nèi)HSL和ATGL含量顯著下降（P＜0.01）。證明甜菜堿可以抑制肝臟中的脂質(zhì)積累。另外，與HFD組小鼠相比，HFD+Bet組小鼠肝內(nèi)AST和ALT的含量顯著下降（P＜0.01）。已有的研究表明，肝細(xì)胞損傷后會釋放出大量的酶，如AST和ALT[13]。表明補飼甜菜堿可以改善高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的肝損傷。

眾所周知，脂肪酸是脂質(zhì)代謝的主要底物，與脂肪細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)[14-15]。脂肪酸在非酒精性脂肪肝的發(fā)展進程中扮演著重要的角色，脂肪酸的積聚既是非酒精性脂肪肝的特征表現(xiàn)，又是引起肝細(xì)胞損傷的因素。我們用氣相色譜法檢測了肝內(nèi)的脂肪酸組成，探究甜菜堿改善高質(zhì)飲食誘導(dǎo)的肝內(nèi)脂質(zhì)沉積的機制。結(jié)果顯示，補飼甜菜堿可以降低HFD+Bet組小鼠肝臟中 C12:0、C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C18:1n9c、C18:2n6c、C20:0、C22:0 的含量，且 SFA、PUFA、MUFA 含量也顯著下降（P＜0.05），但PUFA所占比例有小幅上升（P＞0.05）。之前的研究報道，C12:0、C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C18:1n9c、C18:2n6c、C2:0、C22:0 皆與肝臟脂肪變性正相關(guān)[16]。PUFA在非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控作用[17]。而SFA可能導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的致病作用，使肝功能受損，最終導(dǎo)致肝功能衰竭[18]。這些結(jié)果與我們之前發(fā)現(xiàn)的補飼甜菜堿可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟功能的結(jié)果一致。之前的研究表明，PUFA可以通過激活脂肪酸氧化中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑（PPARα）及增強脂肪酸β-氧化，從而減少脂肪酸的合成和轉(zhuǎn)運[19]。并且，PPARa在脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，PPARa的敏感性下降會導(dǎo)致能量消耗減少，造成脂肪酸在肝臟內(nèi)聚集形成脂肪肝[20]。而SREBP-1C表達量的下降能夠抑制脂肪酸的合成[19]。因此，我們對肝內(nèi)脂肪酸合成和代謝相關(guān)基因的表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)，相比HFD組小鼠，HFD+Bet組小鼠肝內(nèi)PPARα表達水平顯著上升，而SREBP-1C表達水平顯著下降（P＜0.01），同時其他脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達水平均顯著下降（P＜0.01）、脂肪酸代謝相關(guān)基因表達水平顯著上升（P＜0.01）。此前有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中脂質(zhì)過度積累的根本原因主要是新的脂肪酸的合成和脂肪酸氧化的抑制[21]，這與本研究的結(jié)果恰好相反。這些結(jié)果暗示，甜菜堿可以通過調(diào)控脂肪酸的組成來影響脂質(zhì)代謝，進而改善高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的肝臟脂質(zhì)代謝功能。

綜上所述，本研究表明補飼甜菜堿可預(yù)防高脂飲食誘導(dǎo)小鼠的非酒精性脂肪肝，其機制可能涉及肝脂肪酸代謝改變。